N-乙酰半胱氨酸聯合萬古霉素對耐甲氧金黃色葡萄球菌及其生物膜的清除作用研究

鄭靖杰, 阿不都賽米·艾買提,3, 薛德文, 曹 力,2,3

(1新疆醫科大學第一附屬醫院關節外科, 2新疆地區高發疾病研究教育部重點實驗室, 3新疆骨科疾病臨床醫學研究中心, 烏魯木齊 830011)

在臨床疾病的治療中,各種感染始終是困擾無數外科醫生的難題[1]。超過65%的感染均與生物膜的產生有關[2]。細菌生物膜(Biofilm,BF)是細菌黏附于生物材料或組織表面后,通過分泌胞外多糖,纖維蛋白等物質,進一步聚集黏附,最終構成一個由多糖蛋白復合物、細菌、核酸等物質共同組成的,緊密黏附于載體表面的膜狀物[3]。耐甲氧金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)作為金黃色葡萄球菌的亞種,有著很強的生物膜形成能力[4]。因其對萬古霉素表現敏感,使得萬古霉素成為對抗MRSA菌感染的首選抗生素[5],但生物膜的存在大大提高了MRSA菌對抗抗生素的能力[6]。生物膜可在多種骨科材料表面附著[7]。細菌在假體及周圍組織的定植形成的生物膜,導致假體周圍感染遷延不愈,反復發作[8]。因此生物膜的有效清除手段成為關節外科研究的重點。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是半胱氨酸(L-Cysteine,Cys)的N-乙酰化的衍生產物,其具有很強的溶解黏液作用。NAC通過使大分子糖蛋白多肽鏈中的二硫鍵(-S-S-)斷裂,使黏液液化[9]。NAC對生物膜的清除作用雖然目前國內外學者做了一些相關研究[10],但聯合抗菌素使用實驗較少。本實驗采用金黃色葡萄球菌中易形成生物膜,臨床較難處理的MRSA菌種作為研究對象[11],研究NAC聯合萬古霉素對MRSA菌及其生物膜的清除效果。本研究首次通過激光共聚焦及多時間段生物膜內細菌定量分析證實乙酰半胱氨酸聯合萬古霉素對MRSA細菌生物膜結構及生物膜內細菌的影響,為聯合用藥清除細菌生物膜提供了思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器主要試劑及材料:MRSA(BAA-1556,美國ATCC),萬古霉素(VIANEX,希臘),N-乙酰半胱氨酸(C8460,Solarbio),電鏡固定液(賽維爾,中國武漢),LB 肉湯(索萊寶,中國北京),瓊脂粉(Biofroxx 公司,德國),LIVE/DEAD細菌活力檢測試劑盒(L7012,ThermoFisher Scientific公司,美國),1%結晶紫染色液(G1062,Solarbio),PBS粉末(Gibico公司,美國),共聚焦用玻璃培養皿(YA0570,Solarbio),麥氏比濁管(YA0180,Solarbio)。主要儀器:酶標儀(ThermoFisher Scientific公司,美國),掃描電子顯微鏡JSM-7610FPlus(電子株式會社,日本),激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡公司),臨界點干燥儀(K850)(Quorum 公司,英國),離子濺射儀(MC1000)(HITACHI 公司,日本),加熱型超聲波清洗儀(沃信儀器制造,中國無錫),恒溫培養箱(精宏,中國上海)。實驗完成于新疆地區高發疾病研究教育部重點實驗室(新疆醫科大學),新疆骨科疾病臨床醫學研究中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 MRSA細菌生物膜體外培養 使用10 μL接種環挑取MRSA菌并接種于25 mL LB肉湯液體培養基中。液體培養基置于細菌搖床,37℃搖菌12 h。利用麥氏比濁管測算細菌濃度,并應用LB肉湯稀釋菌液至106CFU/mL濃度。選取6孔板,每孔放入22 mm×22 mm無菌蓋玻片,加入4 mL,濃度為106CFU/mL的菌液。將6孔板放入37℃細菌培養箱中,靜置培養1、6、12、24、48、72 h,培養完成后取出蓋玻片,置入無菌PBS溶液中清洗3次,洗去未附著的細菌。使用0.1%結晶紫溶液染色20 min。染色完成后以PBS清洗3次,去除未結合的染料。通過光學顯微鏡觀察生物膜形成狀態。

1.2.2 實驗分組 本研究分5組,分別為空白對照組、萬古霉素組、乙酰半胱氨酸組、萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組、萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組。空白對照組不予以任何藥物,細菌自然生長形成的生物膜作為對照。萬古霉素組予以5 mg/mL濃度萬古霉素進行干預。乙酰半胱氨酸組予以20 mg/mL藥物進行干預。萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組予以5 mg/mL濃度的萬古霉素以及5 mg/mL濃度的乙酰半胱氨酸進行干預。萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組予以5 mg/mL濃度的萬古霉素以及20 mg/mL濃度的乙酰半胱氨酸進行干預。

1.2.3 生物膜面積半定量測定 通過結晶紫染色法對生物膜面積進行半定量測定與分析。對96孔板進行標記并分組。分組的各孔均加入100 μL濃度為106CFU/mL的菌液。將96孔板置入37℃恒溫箱培養48 h,使生物膜附著于各孔孔壁及底部。單通道移液器移去孔內培養基,按照分組于各組加入藥物。加樣完成后置入37℃恒溫箱培養24 h。棄去各組培養基。重新加入無菌PBS清洗3次,洗去未黏附的細菌。自然晾干后各孔加入0.1%結晶紫溶液100 μL,染色20 min。然后以PBS洗去多余的結晶紫。加入無水乙醇溶解生物膜內的結晶紫5 min,將溶解后的液體移至新的96孔板并做對應標記分組。通過酶標儀測定590 nm處的光密度(Optical density,OD)值。

1.2.4 生物膜內細菌定量分析 建立生物膜方法同前。備新的6孔板,將帶有生物膜的蓋玻片放于各孔內,按照分組于各組加入藥物。每24 h更換對應藥物濃度的培養基。培養24、48及72 h后將蓋玻片取出。用50 mL無菌PBS清洗3次,去除殘余藥物。將清洗后的玻片置于50 mL無菌離心管內,加入40 mL無菌PBS,37℃超聲震蕩20 min以釋放生物膜內殘存細菌。取100 μL上述超聲震蕩后的液體,稀釋10倍、100倍、1 000倍后,以L型涂布棒均勻涂布于LB瓊脂培養板,各涂3板。放置于37℃培養箱中培養24 h。統計各平板菌落數。此實驗重復3次。計算公式:每毫升震蕩液中細菌濃度=(菌落數×10×稀釋倍數)CFU/mL。

1.2.5 生物膜結構分析 通過熒光染色及激光共聚焦觀測,對生物膜結構進行分析。各組準備共聚焦玻璃培養皿3個,培養皿中加入1 mL,濃度為106CFU/mL的菌液,培養48 h,使生物膜附著于皿上。棄去培養皿中原有培養基,按照分組加入各組藥物。在37℃恒溫箱內培養24 h后棄去培養基,重新加入無菌PBS緩沖液清洗3次。按照LIVE/DEAD BacLight細菌活力檢測試劑盒說明書。每1 mL 生理鹽水加入5 μL SYTO9和5 μL PI配置染色液。每個培養皿加入1 mL染色液進行染色,遮光染色15 min。染色完成后棄去染色液,加入生理鹽水清洗3次,洗去多余染料。加入1 mL生理鹽水,避光轉移至共聚焦顯微鏡下觀察。于480 nm波長下觀測SYTO9染色,于530 nm波長下觀測PI染色并進行拍照。利用NIS Viewer Ver420對圖像進行處理。

1.2.6 生物膜形態觀察 通過掃描電子顯微鏡對生物膜的形態進行觀察。選取6孔板,每孔放入22 mm×22 mm無菌蓋玻片,加入4 mL,濃度為106CFU/mL的菌液,培養48 h,使生物膜附著于玻片上。備新的6孔板,將帶有生物膜的蓋玻片放于各孔內,按照分組加入各組藥物。在37℃恒溫箱內培養24 h后棄去培養基,重新加入無菌PBS緩沖液清洗3次。加入2 mL電鏡固定液4℃冰箱固定過夜,依次用50%、75%、80%、95%、無水乙醇的梯度乙醇中脫水,每個15 min。用臨界點干燥儀干燥,離子濺射儀進行真空噴鍍金粉。于掃描電鏡下觀察,放大倍數10 000倍。

2 結果

2.1 MRSA細菌生物膜體外培養以及最大密度生成時間測算對生物膜進行結晶紫染色后于400倍光學顯微鏡下觀察,可見1～48 h過程中生物膜黏附逐步增加,于48 h達到最大面積。72 h生物膜密度更大,但早期黏附呈片狀分布的生物膜部分分散。因此本實驗過程中生物膜體外形成時間均為48 h,如圖1所示。

2.2 N-乙酰半胱氨酸聯合萬古霉素對MRSA細菌生物膜清除效果的測試MRSA菌在各分組載體表面形成生物膜的半定量結果(波長=590 nm)分別為空白對照組1.32±0.60,萬古霉素組1.05±0.15,乙酰半胱氨酸組0.53±0.20,萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組0.35±0.11,萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組0.29±0.10。與空白對照組比較,萬古霉素組、乙酰半胱氨酸組、萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組、萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組生物膜面積均減少,差異有統計學意義(P<0.05);與萬古霉素組比較,乙酰半胱氨酸組、萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組、萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組生物膜面積均減少,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2。

注: 與空白對照組比較, #P<0.05; 與萬古霉素組比較, *P<0.05。

2.3 N-乙酰半胱氨酸聯合萬古霉素對MRSA菌生物膜內細菌清除效果測定分別對24、48、72 h各組間數據進行比較,各時間段生物膜內殘余細菌量為空白對照組>乙酰半胱氨酸組>萬古霉素組>萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組>萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組,各組間差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組生物膜內殘余細菌量

2.4 N-乙酰半胱氨酸聯合萬古霉素對MRSA細菌生物膜結構和形態影響掃描電鏡結果(圖3)顯示:空白對照組的載體表面周圍存在大量的黏液狀胞外分泌物黏附,大量MRSA菌黏附于生物膜內外。萬古霉素組MRSA菌黏附較空白對照組明顯減少,但仍可見大量的殘余胞外分泌物黏附于載體表面,構成生物膜結構。乙酰半胱氨酸組胞外分泌物明顯減少,黏附細菌數量較空白對照組明顯減少,部分細菌呈單個黏附。萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組黏附細菌數明顯減少,黏附細菌周圍的胞外分泌物也明顯減少,未見明顯簇擁呈團塊狀的細菌。萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組中黏附細菌數進一步減少,未見片狀細菌生物膜存在。

圖3 掃描電鏡下各組生物膜形態

激光共聚焦結果(圖4)顯示:經SYTO9及PI染色后,在激光共聚焦下觀察活菌呈綠色熒光,死菌呈現為紅色熒光。活/死細菌重疊處呈黃色。空白對照組:活菌為主,伴有部分死菌共同形成細菌生物膜。萬古霉素組:存在大量死菌,但是伴較多的活菌存在于其中。乙酰半胱氨酸組:可見較多活菌,死菌較少,但活/死細菌黏附面積明顯減少。萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組:活/死細菌黏附數量均較前減少,大多數活菌呈單個分布,未見片狀分布的活/死細菌。萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組:活/死細菌黏附數量均進一步減少,活菌呈單個分布。

圖4 激光共聚焦下各組生物膜結構

3 討論

假體周圍感染作為人工關節置換術后最嚴重的并發癥之一,其治療手段一直是關節外科的研究熱點和攻克的重點難點[12-13]。臨床針對假體周圍感染翻修最主要的治療手段是手術清創聯合抗生素治療[14-15]。由于細菌生物膜的存在,即使是清創術聯合抗生素的治療后,仍然存在感染復發的可能[16]。因此細菌生物膜的徹底清除是假體周圍感染翻修治療成功與否的關鍵所在。

在臨床中,抗生素的局部應用確實能在很大程度上降低感染的發生,且存在多個優勢:局部藥物濃度高,可快速達到殺菌濃度;可減少全身不良反應;提高藥物利用率等[17]。研究證實,高于10 mg/mL濃度的萬古霉素可能會導致骨細胞的凋亡[18]。考慮到局部用藥濃度[19],本研究中采用的萬古霉素濃度為5 mg/mL。在NAC對細菌生物膜的作用相關研究中,Eroshenko等[20]證實NAC對部分葡萄球菌株的最低抑菌濃度(MIC)為25 mg/mL,在0.5 MIC濃度時可對部分葡萄球菌的生物膜產生清除作用。Kuruoglu等[21]對置入導管表面的細菌生物膜感染研究中,發現6 mg/mL的NAC對生物膜清除起到了一定的清除作用。因此在此次實驗中低高劑量組分別加用濃度為5 mg/mL和20 mg/mL的NAC。

通過對結晶紫染色的結果分析,發現空白對照組及萬古霉素組的生物膜面積高于乙酰半胱氨酸組、萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組及萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組,且不同濃度NAC聯合萬古霉素使用時,生物膜面積也存在著顯著差異(P<0.01)。共聚焦觀察發現,空白對照組、萬古霉素組存在大量死菌構成的細菌生物膜黏附。萬古霉素作為MRSA菌的敏感抗生素,其單獨應用即使在較高濃度下維持72 h仍然有較多的細菌存活,結合較多的生物膜面積,推測生物膜的形成影響了萬古霉素對MRSA菌的殺滅作用。在萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組和萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組中,生物膜面積和活/死細菌均有著較高的清除率,且隨著NAC濃度的增加,構成生物膜的活/死細菌黏附數量進一步減少。結晶紫染色及激光共聚焦觀察從生物膜面積和構成生物膜的活/死細菌比例上初步證實NAC與萬古霉素的聯合應用可有效減少生物膜的產生,提高對生物膜及細菌的清除效果。

掃描電鏡結果顯示,空白對照組細菌團狀聚集黏附于致密的生物膜表面;萬古霉素組生物膜結構無明顯改變,但黏附的細菌數量減少,同時可見部分細菌分布于生物膜內;乙酰半胱氨酸組可見胞外分泌物明顯減少,黏附細菌數量較空白對照組明顯減少,部分細菌呈單個黏附。在萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組和萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組中,細菌與生物膜進一步減少,證實NAC可有效減少生物膜的產生,使MRSA菌無法通過生物膜屏障對抗抗生素的滲透,顯著提高了抗生素對細菌的殺滅作用。

通過超聲裂解生物膜[22],并以LB-瓊脂培養板計數法對生物膜內細菌定量的實驗中,乙酰半胱氨酸組細菌定量結果在48和72 h均有增加,說明NAC本身抑菌效果不強。導致乙酰半胱氨酸組比空白對照組生物膜內細菌定量減少的原因為乙酰半胱氨酸組內生物膜面積減少,細菌黏附率降低,未黏附的浮游細菌在實驗中被沖洗消除。萬古霉素組中生物膜內MRSA菌數量隨時間的增加持續減少,但持續應用72 h后仍然有較多的殘余。萬古霉素+乙酰半胱氨酸低劑量組和萬古霉素+乙酰半胱氨酸高劑量組生物膜內殘余細菌定量相比萬古霉素組,MRSA菌的清除效果明顯增加,且清除效果隨NAC濃度呈劑量依賴性(P<0.01)。多時段的細菌定量分析證實NAC與萬古霉素的聯合應用可加強萬古霉素對MRSA菌的清除作用。

本研究通過在體外建立MRSA菌生物膜,多種方法共同證實NAC與萬古霉素的聯合應用可以有效清除細菌生物膜,并顯著增加生物膜內細菌的清除率。由于此研究為體外實驗,生物膜生長及干預環境可控性強,變量單一,與體內環境中復雜的生物膜感染環境存在著一定的差異。同時假體周圍感染的治療過程中,局部用藥有著濃度高、藥物半衰期不同于體內代謝等特點,應在后期通過建立假體周圍感染動物模型[23],進一步證實NAC在體內環境中的作用效果,并探尋其調控機制及可能存在的靶點,闡明其作用機制,為假體周圍感染的治療提供理論依據。