p62敲除對(duì)細(xì)胞自噬的影響及其對(duì)泛素化修飾蛋白募集的作用

劉世玉, 馮學(xué)召, 古麗妮尕爾·司馬義, 席 慶, 阿仙姑·哈斯木, 米 娜

(新疆醫(yī)科大學(xué)1生物化學(xué)教研室, 2病理生理學(xué)教研室, 3生物學(xué)教研室, 烏魯木齊 830017;4新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院, 烏魯木齊 830092;5新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院, 烏魯木齊 830054)

自噬是一種在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起多種作用的溶酶體降解途徑,分為選擇性自噬和非選擇性自噬[1]。饑餓、細(xì)胞器損傷等反應(yīng)都會(huì)增加細(xì)胞自噬[2]。在選擇性自噬中,p62/Sequestosome-1作為一種支架蛋白,用來降解泛素化基質(zhì)的載體[3],并通過自身的互作作用和泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Ubiquitin binding domain,UBA)結(jié)合,進(jìn)一步促進(jìn)泛素化聚集體的形成和降解。泛素-蛋白酶體(Ubiquitin-proteasome system,UPS)和自噬是細(xì)胞中最主要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng),相關(guān)研究證實(shí)了兩者間存在密切聯(lián)系,泛素作為這兩類系統(tǒng)共同的底物識(shí)別信號(hào),在其中起到連接的作用[4]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)被自噬相關(guān)蛋白酶ATG4裂解形成胞質(zhì)LC3Ⅰ,被進(jìn)一步識(shí)別后,LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamine,PE)結(jié)合形成LC3Ⅱ,即LC3酯化[5]。與外膜結(jié)合的LC3Ⅱ被ATG4裂解,被重新用于新一輪的酯化[6]。前期研究證實(shí)了這些蛋白分子在自噬中的核心作用,p62和多聚泛素化蛋白是p62體的支架,而作為自噬的成核位點(diǎn)的p62體被隔離在自噬體中[7]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察和對(duì)比野生型(Wild Type,WT)和p62基因敲除(p62 knockout,p62-KO)的大鼠腎上皮細(xì)胞(NRK)經(jīng)饑餓處理后的自噬體形成、LC3蛋白陽性囊泡點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量變化、LC3酯化和泛素化修飾蛋白(Ub)的表達(dá)水平,證實(shí)p62敲除不影響非選擇性自噬,并初步探究p62與泛素化修飾蛋白結(jié)合對(duì)自噬降解途徑的具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑C2plus激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司);Heracell 150iCO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司);KS18生物安全柜(美國Thermo Scientific公司);垂直電泳儀、電泳槽及相關(guān)配套設(shè)備、濕轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)、高速低溫離心機(jī)(美國Sigama公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);DPBS培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(以色列BI公司,04-002-1A);谷氨酰胺(美國Thermo Fisher Scientific公司,25030081);磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國Hyclone公司);青霉素-鏈霉素(美國Hyclone公司,SV30010.01);大鼠腎上皮細(xì)胞(Normal rat kidney,NRK)、p62基因敲除的細(xì)胞由清華大學(xué)生命科學(xué)系俞立教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送;LC3(# PM036,1∶1 000)、p62(# PM045,1∶1 000)均購自美國MBL公司;GAPDH(美國Affinityaffbiotech公司,AF7021);Goat Anti-Rabbit Ig(美國SouthernBiotech公司,4010-05);Ubiquitin(中國CST公司,# 3936S,1∶5 000)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 用含有10%胎牛血清和1% (青霉素-鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,置于37℃、5%細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)至全皿的90%時(shí),對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代、鋪板及收樣。將野生型(Wild Type,WT)和p62基因敲除(p62 knockout,p62-KO)的NRK細(xì)胞分別分為野生型陰性對(duì)照組(WT CT組)和野生型饑餓4 h組(WT Sta4 h組)、p62基因敲除陰性對(duì)照組(p62-KO CT組)和p62基因敲除饑餓4 h組(p62-KO Sta4 h組)。WT CT組和p62-KO CT組中加入普通培養(yǎng)基,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行空白對(duì)照處理;WT Sta4 h組和p62-KO Sta4 h組中加入饑餓培養(yǎng)基,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓4 h處理。

1.2.2 鑒定p62敲除的細(xì)胞 免疫印跡法檢測(cè)野生型(WT)細(xì)胞與p62基因敲除(p62-KO)細(xì)胞中p62的表達(dá)水平。

1.2.3 電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬情況 在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)野生型(WT)細(xì)胞和p62基因敲除(p62-KO)細(xì)胞,用1∶1的2.5%戊二醛和DMEM在室溫下固定5 min;棄去培養(yǎng)基,2.5%戊二醛、4℃中孵育45 min;用0.1 M碳酸鈉緩沖液(pH 7.3)沖洗2次,20 mM甘氨酸處理5 min,洗滌5 min后,1 mg/mL DAB室溫孵育2 min,加入過氧化氫至0.03%,繼續(xù)孵育15 min,用電子顯微鏡(TEM)觀察WT細(xì)胞和p62-KO細(xì)胞中的自噬體數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)LC3蛋白陽性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量 將細(xì)胞置于蓋玻片上生長,棄去培養(yǎng)基,PBS清洗1次,室溫下用4%的多聚甲醛固定10 min,PBS清洗3次;含有0.1%皂素的山羊血清中封閉10 min,使細(xì)胞穿孔;在山羊血清中孵育30 min,用熒光一抗對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色1 h,PBS清洗3次;細(xì)胞被染色后用熒光二抗室溫避光孵育1 h,PBS清洗3次;用激光共聚焦顯微鏡觀察WT細(xì)胞和p62-KO細(xì)胞中LC3蛋白陽性囊泡點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量(以每次實(shí)驗(yàn)大于50個(gè)細(xì)胞并在5個(gè)視野以上進(jìn)行統(tǒng)計(jì))。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)LC3的酯化水平及泛素化修飾蛋白的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長期的WT和p62-KO細(xì)胞,以3×105個(gè)/mL接種至六孔板中,培養(yǎng)14 h后,PBS清洗3次,DPBS饑餓處理4 h。免疫印跡法(Western Blotting,WB)檢測(cè)細(xì)胞中泛素化修飾蛋白(Ub)和自噬體標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平。同上將待處理的細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理4 h后,棄去培養(yǎng)基,PBS沖洗1次,加入適量細(xì)胞裂解液,100℃變性15 min,在8%～12%的SDS-PAGE上電泳,濕轉(zhuǎn)法至醋酸纖維素膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,免疫結(jié)合抗體室溫孵育1 h,化學(xué)發(fā)光法(ECL)進(jìn)行X膠片的顯影。采用Fiji-Image進(jìn)行灰度值的統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 p62基因敲除細(xì)胞的鑒定免疫印跡法鑒定野生型(WT)細(xì)胞與p62基因敲除(p62-KO)細(xì)胞中p62基因的敲除情況,結(jié)果顯示,與WT細(xì)胞比較,p62-KO細(xì)胞中未見p62蛋白表達(dá),提示p62-KO細(xì)胞中的p62基因被成功敲除(圖1)。

圖1 p62基因敲除細(xì)胞的鑒定

2.2 WT和p62-KO細(xì)胞的自噬情況結(jié)果顯示,饑餓處理4 h后,WT和p62-KO細(xì)胞中均能觀察到自噬結(jié)構(gòu)(包括自噬體和自噬溶酶體),且自噬體的數(shù)量在p62-KO細(xì)胞中未見明顯減少(圖2)。

A: WT B: p62-KO

2.3 饑餓誘導(dǎo)下的自噬細(xì)胞中LC3蛋白陽性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量的比較野生型(WT)和p62基因敲除(p62-KO)的NRK細(xì)胞饑餓處理4 h后,與WT CT組比較,WT Sta4 h組中LC3蛋白陽性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與p62-KO CT組比較,p62-KO Sta4 h組中LC3蛋白陽性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。饑餓處理4 h后,WT Sta4 h組和p62-KO Sta4 h組中LC3蛋白陽性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1、圖3)。

表1 饑餓誘導(dǎo)下的自噬細(xì)胞中LC3蛋白陽性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量的比較

注: A, 圖中綠色點(diǎn)代表LC3蛋白陽性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量(比例尺:10 μm); B, 饑餓處理后WT和p62-KO細(xì)胞中LC3蛋白陽性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量。

2.4 p62敲除對(duì)細(xì)胞中自噬關(guān)鍵蛋白LC3酯化的影響野生型(WT)和p62基因敲除(p62-KO)的NRK細(xì)胞饑餓處理4 h后,與WT CT組比較,WT Sta4 h組中LC3蛋白酯化水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01);與p62-KO CT組比較,p62-KO Sta4 h組中LC3蛋白酯化水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。饑餓處理4 h后,WT Sta4 h組和p62-KO Sta4 h組中LC3蛋白酯化水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2、圖4)。

表2 p62敲除對(duì)細(xì)胞中自噬關(guān)鍵蛋白LC3酯化的影響

注: A, 免疫印跡法檢測(cè)自噬關(guān)鍵蛋白LC3蛋白的酯化水平; B, 饑餓處理后WT和p62-KO細(xì)胞中LC3蛋白的酯化水平。

2.5 p62與泛素化修飾蛋白結(jié)合對(duì)細(xì)胞自噬的影響野生型(WT)和p62基因敲除(p62-KO)的NRK細(xì)胞饑餓處理4 h后,與WT CT組比較,WT Sta4 h組中Ub蛋白和LC3蛋白表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01);與p62-KO CT組比較,p62-KO Sta4 h組中Ub蛋白和LC3蛋白表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05)。饑餓處理4 h后,WT Sta4 h組和p62-KO Sta4 h組中Ub蛋白和LC3蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3、圖5)。

表3 p62與泛素化修飾蛋白結(jié)合對(duì)細(xì)胞自噬的影響

3 討論

自噬主要負(fù)責(zé)清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以及受損的細(xì)胞器,在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用。研究表明,p62通過溶酶體介導(dǎo)自噬來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)的聚集及降解[8]。p62能夠?qū)⒎核鼗鞍?如tau,遞送到蛋白酶體中進(jìn)行降解[9]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)在短壽命、錯(cuò)誤折疊和受損的蛋白質(zhì)降解中起到了重要作用[10],但p62對(duì)泛素化修飾蛋白在自噬體形成中的的相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

本研究發(fā)現(xiàn),在饑餓處理后的p62-KO細(xì)胞中,自噬體數(shù)量未見明顯減少,而LC3蛋白陽性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量顯著增多,提示在饑餓后的p62-KO細(xì)胞中,自噬強(qiáng)度增加,自噬流正常,說明p62敲除并不影響自噬的發(fā)生。p62作為一種自噬底物受體,在選擇性自噬中與泛素化底物蛋白相結(jié)合[11]。研究表明,自噬與泛素化蛋白酶體系統(tǒng)間存在相關(guān)性,抑制蛋白酶體的表達(dá)能夠誘導(dǎo)自噬,誘導(dǎo)后的自噬能夠降解泛素化及錯(cuò)誤折疊的蛋白,而抑制自噬會(huì)引起短期蛋白質(zhì)的聚集,干擾一個(gè)系統(tǒng)的功能會(huì)影響另一個(gè)系統(tǒng)的表達(dá)[12]。本研究通過調(diào)控p62的分子水平,發(fā)現(xiàn)在p62-KO細(xì)胞中泛素化修飾蛋白是積累的,這表明p62在選擇性自噬中的作用不可或缺。p62通過特定的結(jié)構(gòu)域,如UBA和LC3結(jié)合區(qū)域,與泛素化修飾蛋白相互作用,說明p62能夠?qū)⒎核鼗揎椀鞍滓磷允审w,從而促進(jìn)自噬的降解。這一研究揭示了p62作為一個(gè)自噬適配體蛋白的重要功能。p62的過度表達(dá)與多種疾病的發(fā)展相關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)p62的泛素化修飾和翻譯后修飾可以影響其與泛素化修飾蛋白的相互作用及募集能力[14],這表明p62的調(diào)控機(jī)制是多樣且復(fù)雜的,可能涉及多個(gè)信號(hào)通路和修飾方式的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示,與WT CT組和p62-KO CT組比較,WT Sta4 h組和p62-KO Sta4 h組中Ub蛋白表達(dá)水平顯著升高,且在p62敲除細(xì)胞中有更多的積累,特別是LC3酯化水平的升高,強(qiáng)調(diào)了p62與Ub修飾的蛋白結(jié)合后使自噬作用增強(qiáng)。

本研究證實(shí)了p62在選擇性自噬中的重要作用,作為底物接頭蛋白,p62能夠募集泛素化修飾蛋白并促進(jìn)其降解,這有助于深入了解細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制。通過比較WT和p62-KO細(xì)胞中自噬體的形態(tài)和數(shù)量,發(fā)現(xiàn)p62的敲除并不影響自噬體的形成,但影響了選擇性自噬體底物的凝聚和降解。這表明自噬過程中不同組分的功能可以分開調(diào)節(jié),從而揭示了選擇性自噬的調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。

綜上,本研究中p62敲除后泛素化蛋白的積累,尤其是饑餓處理后泛素修飾蛋白的積累加劇,進(jìn)一步說明p62在自噬的泛素化系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能。因此,本研究對(duì)于深入理解自噬與疾病之間的關(guān)系,并為相關(guān)疾病的治療提供新的治療靶點(diǎn)和策略具有重要意義。