ADSCs、VEGF和GM-CSF修復成纖維細胞放射性損傷的機制研究

尹小芳 秦嶺 楊超 閻海萍 栗穎利 李敏

[摘要]目的：研究對比脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）、血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）對放射后成纖維細胞（Fibroblasts，Fb）修復的影響機制。方法：使用劑量為8 Gy的X線放射源，對大鼠的成纖維細胞進行單次X線照射，建立ADSCs與放射后成纖維細胞的共培養模型。分別設置單純放射后成纖維細胞為Fb2組，ADSCs與放射后成纖維細胞共培養為Fb3組，VEGF+放射后成纖維細胞為VEGF組，GM-CSF+放射后成纖維細胞為GM-CSF組。通過VEGF、GM-CSF、ADSCs分別干預放射損傷的成纖維細胞，觀察細胞凋亡、增殖、細胞周期及Western-Blot檢測信號通路激活情況驗證結果。結果：VEGF、GM-CSF、ADSCs分別作用于放射損傷的成纖維細胞，可以促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，加快細胞周期由G2/M向G1/S進展，與照射組相比差異有統計學意義（P＜0.05），其程度強弱依次為ADSCs、GM-CSF、VEGF。VEGF組和GM-CSF組p-Akt蛋白和p-Erk蛋白表達較照射組上調，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；相同濃度ADSCs、GM-CSF和VEGF促進p-Akt蛋白和p-Erk蛋白表達，作用程度強弱依次為ADSCs、GM-CSF、VEGF，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt）通路和絲裂原激活蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）通路可能發揮著重要作用，比如在VEGF和GM-CSF作用于ADSCs治療放射損傷后成纖維細胞過程中。ADSCs修復放射損傷后成纖維細胞的效果明顯好于VEGF和GM-CSF單獨修復放射損傷后成纖維細胞，表明可能還有其他的潛在作用因子。結論：ADSCs、VEGF和GM-CSF干預的放射損傷后成纖維細胞主要通過增強細胞增殖、抑制細胞凋亡及加快細胞周期由G2/M向G1/S發展。

[關鍵詞]脂肪干細胞；成纖維細胞；輻射；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；血管內皮生長因子

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）08-0029-05

Study on the Mechanism of ADSCs， VEGF and GM-CSF in Repairing Radiation Damage of Fibroblasts

YIN Xiaofang1，QIN Ling1，YANG Chao3，YAN Haiping4，LI Yingli2，LI Min1

（1.Department of Nuclear Medicine of the 960th Hospital of the PLA，Jinan 250031，Shandong，China; 2.Department of Burn and Plastic Surgery， 960th Hospital of the People's Liberation Army，Jinan 250031，Shandong，China; 3.People's Liberation Army Navy Special Medical Center Plastic Surgery，Shanghai 200000，China; 4.Jinan Military Region 11th Retired Cadre Rest Center，Jinan 250000，Shandong，China）

Abstract： Objective? To discuss the effect mechanism of adipose-derived stem cells（ADSCs） on irradiation fibroblasts （Fb） through vascular endothelial growth factor （VEGF） and granulocyte-macrophage colony stimulating factor （GM-CSF）. Methods? Rats Fb were irradiated with a dose of 8 Gy X-ray source， and the co-culture of ADSCs and post-irradiated Fb was established. ADSCs were co-cultured with irradiation Fb as ADSC group， VEGF+ irradiation Fb was set as VEGF group， and GM-CSF+ after-radiation Fb was set as GM-CSF group. VEGF， GM-CSF and ADSCs were used to intervene in radiation-injured fibroblasts， respectively， and cell apoptosis， proliferation， cell cycle， and activation of signaling pathways by Western-Blot were analyzed to verify the results. Results? VEGF， GM-CSF and ADSCs intervened in radiation-injured fibroblasts， respectively， and the degrees of promoting cell proliferation， anti-apoptosis and accelerating cell cycle. Compared with the irradiation group， the differences were statistically significant（P＜0.05）， and its degree was ADSCs， GM-CSF， and VEGF in order. The expressions of p-Akt protein and p-Erk protein in the VEGF group and GM-CSF group were up-regulated compared with the irradiation group， and the difference was statistically significant （P＜0.01）. The expression of p-Erk protein and the degree of action were ADSCs， GM-CSF， and VEGF in order， and the difference was statistically significant （P＜0.01）. The PI3K-Akt （phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B） pathway and the MAPK （mitogen-activated protein kinase） pathway may play an important role， such as the role of VEGF and GM-CSF in the treatment of ADSCs on irradiation fibroblasts. The effect of VEGF and GM-CSF is much weaker than that of ADSCs， which implies that they may only be part of the cytokines during the progress of radiation-induced skin repairment. Conclusion? The radiation-injured fibroblasts treated with VEGF and GM-CSF demonstrated enhanced proliferation activity， reduced apoptosis， and accelerated cell cycle progressed from G2/M to G1/S.

Key words： adipose-derived stem cells; fibroblasts; radiation; Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; Vascular endothelial growth factor

放射性皮膚損傷是指皮膚受輻射線作用發生的皮膚損傷，臨床上近85%～95%的腫瘤患者因放射性治療出現不同程度的皮膚損傷[1]。臨床上，常見的治療有高壓氧、激光局部治療、局部藥物涂抹及外科手術等，但這些方式往往效果欠佳，易導致局部損傷加重，病變范圍擴大。脂肪干細胞是一種具有自我更新及向多種組織細胞分化能力的多能干細胞，并可分泌多種細胞因子、生長因子，具有延緩輻射纖維化、促進新生血管及肉芽組織形成等作用，在再生醫學中發揮著重要作用[2]。

輻射損傷引起成纖維細胞功能障礙，而肌成纖維細胞是產生細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）的主要細胞，成纖維細胞增殖受抑制及ECM生成減少會導致傷口愈合不良。Haubner F等發現ADSCs可能通過分泌細胞因子和生長因子修復損傷后成纖維細胞及加速微血管密度的形成，同時不會造成成纖維細胞過度活化，形成皮膚瘢痕[3]。但是，目前的研究都是通過蛋白質檢測篩選出可能影響修復的細胞因子，而沒有具體驗證這些細胞因子是否對放射性皮膚損傷修復過程產生影響。

本研究發現ADSCs可能通過分泌血管內皮生長因子和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、內皮細胞生長因子（Endothelial cell growth factor，EGF）等多種因子影響放射后成纖維細胞的修復[4]。為了驗證這些細胞因子是否在該過程中起作用，本實驗選取了ADSCs、GM-CSF和VEGF，設置照射組以及ADSCs組、GM-CSF組、VEGF組分別與體外放射后成纖維細胞共培養，來初步驗證它們對放射后成纖維細胞產生的影響，現報道如下。

1? 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑：康寧DMEM培養液（低糖）、美國Gibco胎牛血清、美國Gibco胰蛋白酶（0.25%）、美國GibcoⅠ型膠原酶（0.1%）、美國Gibco Dispase酶；直線加速器（德國西門子）；5% CO2細胞培養箱（Thermo scientific，美國）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）；熒光顯微鏡（Olympus，日本）；流式細胞儀（Mihenyi Biotec，德國）；麻醉劑戊巴比妥鈉（Sigma，美國）；Tunnel凋亡試劑盒（羅氏）。

1.2 實驗動物：10只成年雄性SD大鼠，生長周齡為10周齡，體重300～400 g，由長海醫院動物實驗中心提供。本研究經長海醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.3 大鼠ADSCs及皮膚成纖維細胞的提取、培養與鑒定：SD大鼠經頸椎脫臼處死后，于小燒杯中加入適量75%酒精浸泡5 min消毒，剖腹取腹股溝處脂肪組織，并用有齒鑷和顯微剪刀將筋膜、淋巴組織及小血管剔除干凈，然后用適量含1%雙抗的磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer solution，PBS）溶液沖洗3次。用無菌眼科剪將脂肪組織剪碎至糊狀后放置于裝有適量PBS的培養皿中，然后加入約等體積的含0.1%膠原酶I，搖晃均勻后，置于37℃溫箱中1 h，每間隔5 min手動搖勻一次。于干凈離心管中放入消化后的脂肪組織液，取等量含胎牛血清的低糖DMEM培養基加入至消化后的脂肪組織液，以結束膠原酶的繼續消化作用，然后放入離心機中，以1 000 r/min離心10 min，倒掉上層脂肪后，余液體用75μm細胞濾網濾去雜質后置于無菌50 ml離心管，繼續以1 000 r/min，離心5 min，離心后倒掉表層的淡紅色液體，切記不要倒掉底部的沉淀，然后加入含胎牛血清的低糖DMEM重懸細胞液。將細胞懸液加入至無菌培養瓶中，培養于條件為37℃、5%CO2的培養箱中，每隔48 h更換一次培養基，每次倒掉培養基后在倒置顯微鏡下觀察，當培養瓶的瓶底單層細胞豐度達到80%以上時，就可以進行胰酶消化后的傳代操作。取3代細胞活力良好的細胞進行細胞表面CD分子流氏鑒定、體外成脂誘導分化及成骨細胞誘導分化。同上步驟取大鼠背部皮下真皮組織消化離心重懸處理后傳代培養，取第3代成纖維細胞切片做波形蛋白（Vimention）免疫組化。具體實驗步驟及細胞表面CD分子、蛋白及誘導分化鑒定結果參考課題組前期方法[5]。

1.4 成纖維細胞放射模型的建立：取第3代培養的成纖維細胞，加入1～2 ml 0.25%胰蛋白酶消化5 min后，加入等量含胎牛血清低糖DMEM的培養基制成混合細胞液。細胞計數板計數后，以1.5×105個/孔均勻吸取放入6孔板底部，條件培養箱培養24 h后更換培養基，然后將6孔板置于直線加速器平臺，調整培養板位置使光源投射區中心正對培養板，為使放射能量集中于培養板上，可加蓋一塊放射板。直線加速器設置參數能量為6 MV，距離100 cm，劑量8 Gy。停止照射后立即將成纖維細胞與ADSCs共培養。具體實驗步驟參考課題組前期方法[6]。

1.5 共培養模型及分組：共培養模型參考前期實驗組建立的模型。取第3代成纖維細胞和ADSCs，放射后成纖維細胞為Fb2組、ADSCs共培養干預的放射后成纖維細胞為Fb3組、VEGF+放射后成纖維細胞為VEGF組、GM-CSF+放射后成纖維細胞為GM-CSF組。

1.6 CCK-8法檢測Fb細胞增殖活性：取第3代培養的成纖維細胞經胰酶消化后計數，均勻鋪至24孔板中（3.5×104個細胞/孔），Fb2組、GM-CSF組和VEGF組的成纖維細胞采用普通24孔板，24孔Transwell板下室內放置Fb3組的成纖維細胞。8 Gy X線照射每組貼壁后的成纖維細胞，照射后將取3×104個ADSCs接種在Transwell培養皿可取出的上室，GM-CSF組分別加入GM-CSF濃度分別為25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的培養基，VEGF組分別加入VEGF濃度為10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml的培養基，各組設置6個復孔，于37℃、5%CO2條件的孵箱共培養。分別于6 h、12 h、24 h和48 h下室及培養孔中加入含40～50 μl CCK-8的培養基，于37℃孵箱培養0.5～4 h，用光度儀檢測450 nm處OD值，該實驗重復3次。

1.7 流式細胞儀檢測Fb細胞凋亡和周期：取第3代成纖維細胞消化計數后，以每孔1.5×105個細胞鋪至6孔板中，Fb2組、GM-CSF組和VEGF組成纖維細胞鋪在普通6孔板中，Transwell 6孔板的下室中放置Fb3組成纖維細胞。8 Gy X線照射各組貼壁細胞，照射完后ADSCs組成纖維細胞置于接種ADSCs的上室（1.0×105個細胞/孔），GM-CSF組和VEGF組分別加入上述濃度VEGF和GM-CSF培養基，37℃孵箱共培養。培養箱中培養48 h后，各組貼壁細胞經適量胰酶消化處理，Buffer重懸細胞后加入5 μl細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-APC）在室溫條件下培養30 min，然后加入5 μl 7-AAD（7-氨基放線菌素）復染，然后用流氏細胞儀檢測細胞凋亡情況。檢測細胞周期時，用適量PBS將消化后的細胞洗2遍，并加入100 μl PBS，用-20℃的PBS將無水乙醇稀釋至75%，室溫放置約6 h。檢測前離心機以轉速為1 500 r/min離心，倒掉上層乙醇后用適量PBS沖洗，加入熒光染料PI（碘化丙啶）后室溫培養30 min上檢測。

1.8 Western-blot檢測通路變化

1.8.1 蛋白的抽提：各組成纖維細胞培養液倒掉培養基后，用適量PBS沖洗，六孔板每孔加入100～150μl 4℃預冷蛋白裂解液?；厥盏鞍琢呀庖河贓P管，冰上放置30 min，4℃條件下1 200 r/min離心機離心15 min，留取上清液。采用BCA蛋白定量法，于567 nm波長的吸光光度儀測定OD值，確定蛋白濃度，用Loading Buffer調整樣品濃度一致。

1.8.2 電泳和轉膜：配制凝膠固定后，加入電泳液至電泳槽中。用生理鹽水清洗上樣孔后，分別加入等量marker和樣品。電壓調至60 V，待溴酚藍至分離膠后更換100 V電壓跑至底部。剪取適量凝膠及PVDF膜，放入甲醛溶液中30 s。取出凝膠及PVDF膜放入轉膜電泳槽中，加入適量轉膜液，周圍放置適量冰塊，以200 mA電流轉膜90 min。

1.8.3 免疫和顯影：取出電泳后的PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入按說明書方法稀釋后的一抗，4℃搖床過夜。第2天用TBST溶液清洗PVDF膜3次，每次持續10 min。然后加入按說明書方法稀釋后的二抗孵育2 h，TBST溶液清洗PVDF膜3次，每次持續10 min。拍照記錄確定膜在化學發光成像系統中的坐標后，將膜置于HRP底物過氧化物溶液與HRP魯米諾等體積混合液中，30 s后進行化學發光成像。

1.9 統計學分析：Western-blot用Quantity One4.64計算條帶的灰度值進行計算，使用Excel軟件匯總統計CCK-8、凋亡等數據。實驗重復三次，所有數據用Mean±SD表示。所得的值采用SPSS 18.0進行統計學分析，采用多組單因素方差分析處理數據，P＜0.05表示差異有統計學意義。圖形采用GraphPad Prism 6.0制作。

2? 結果

2.1 大鼠ADSCs與成纖維細胞形態學觀察與鑒定：ADSCs貼壁后，倒置顯微鏡下觀察呈多角形，細胞核呈圓形。培養基培養3 d后細胞變成長梭形，細胞核變為橢圓形。ADSCs表面標記流式檢測結果CD29、CD44、CD31和CD45陽性率分別為97.4%、96.9%、4.37%和0.61%。第3代ADSCs經成脂誘導后胞漿內可見脂滴，油紅O染色呈紅色；經成骨誘導后細胞由長梭形變成多角形，可見鈣鹽結晶沉積及礦化結節，誘導15 d后經AKP及茜素紅染色呈陽性。另提取的成纖維細胞外形呈長梭形或多角形，和ADSCs形態類似；同時細胞可檢測出高表達的Vimentin蛋白。見圖1。

2.2 細胞增殖力、凋亡和周期結果：GM-CSF組成纖維細胞較Fb2組成纖維細胞增殖快（P＜0.05）。25 ng/ml、50 ng/ml和100 ng/ml濃度GM-CSF處理后增殖程度遞增。VEGF組成纖維細胞增殖程度較Fb2組快（P＜0.05），10 ng/ml、25 ng/ml和50 ng/ml濃度的VEGF處理后增殖程度遞增，有劑量依賴關系。50 ng/ml GM-CSF組較50 ng/mlVEGF組Fb增殖快（P＜0.05）。50 ng/ml GM-CSF組成纖維細胞抗凋亡作用弱于Fb3組（P＜0.01），較Fb2組強（P＜0.01）；50 ng/ml VEGF組成纖維細胞抑制凋亡作用弱于Fb3組（P＜0.01），較Fb2組強；50 ng/ml GM-CSF組抗凋亡作用強于50 ng/ml VEGF組（P＜0.01）。50 ng/ml GM-CSF組成纖維細胞處于G2期細胞數明顯少于Fb3組P＜0.05）；50 ng/ml GM-CSF組成纖維細胞處于G2期細胞數多于Fb2組（P＜0.01）；50 ng/ml VEGF組成纖維細胞較Fb3組G2期細胞數明顯減少（P＜0.01）；50 ng/ml VEGF組成纖維細胞處于G2期細胞數多于Fb2組（P＜0.05）；50 ng/ml GM-CSF組成纖維細胞處于G2期細胞數多于50 ng/ml VEGF組處于G2期細胞數，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。見表1、圖2～3。

2.3 VEGF和GM-CSF作用通路檢測：結果顯示，50 ng/ml GM-CSF組的p-Erk蛋白表達高于Fb2組，50 ng/ml VEGF組的p-Erk蛋白表達高于Fb2組，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；50 ng/ml GM-CSF組的p-Akt蛋白表達多于Fb2組，50 ng/ml VEGF組的p-Akt蛋白表達高于Fb2組，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。ADSCs、GM-CSF和VEGF對信號通路的激活程度ADSCs＞GM-CSF＞VEGF。見圖4。

3? 討論

放射性皮膚損傷是腫瘤患者接受放射治療后常見的皮膚并發癥，近年來，隨著惡性腫瘤術后放療的普及、外照射和放射性粒子內照射治療逐步成為治療規范，這使得放射性皮膚損傷成為臨床常見病和多發病之一[7]。放射性皮膚損傷傳統治療方法往往難以達到理想的效果，主要是因為長期以來放射性皮膚損傷的預防和管理通?；趥€人經驗，缺乏高質量的大樣本研究和統一的評估標準，各研究結果往往相互矛盾，缺乏科學證據[8]。成纖維細胞在修復放射性皮膚損傷過程中發揮重要作用，輻射損傷刺激后，成纖維細胞一方面在趨化因子的作用下募集至創面分裂增殖，分泌大量膠原纖維及ECM填補創面，與新生毛細血管及炎細胞組成肉芽組織，保護創面。另一方面，成纖維細胞在遷徙運動過程中分化為肌成纖維細胞，具有收縮傷口效應，減小創面面積[9]。

ADSCs目前已廣泛應用于修復各種難治性創面、燒傷燙傷及放射性皮膚損傷等皮膚創面。ADSCs被認為是修復皮膚損傷及重建皮膚損傷組織細胞的來源，將來在大面積皮膚缺損修復方面具有明顯優勢。ADSCs可通過分泌多種細胞因子、生長因子加速血管內皮細胞、成纖維細胞的增殖和新生血管形成，還可促進細胞外基質合成和膠原生成，對肉芽組織基質形成、創面再上皮化及瘢痕組織的形成將產生重要的作用[10]。GM-CSF是調節急性皮膚反應細胞增殖的關鍵因子，GM-CSF可促進巨噬細胞合成及分泌多種細胞因子及生長因子，促進成纖維細胞、血管內皮細胞的增殖，加速創面再上皮化及新生血管形成的作用[11]。劉宏東等在評估GM-CSF治療深Ⅱ度燒傷時，發現GM-CSF可提高創面組織中多種生長因子的表達水平，加速創面修復[12]。VEGF主要由成纖維細胞、血管內皮細胞合成，具有促進內皮細胞活化、新生血管生成的作用，在皮膚創面修復過程中具有重要作用。研究發現VEGF可通過抑制炎癥反應、促進肉芽組織生長及成纖維細胞增殖等方面促進皮膚創面愈合[13]。

本實驗結果表明，VEGF與放射后成纖維細胞共培養，其促進細胞增殖、抑制凋亡以及加快細胞周期方面弱于GM-CSF與放射后成纖維細胞共培養組和ADSCs與放射后成纖維細胞共培養組。進一步說明，ADSCs修復放射后成纖維細胞是多因子共同作用的結果。VEGF與GM-CSF能直接或間接作用于成纖維細胞，促進放射后成纖維細胞的修復；還可通過刺激Erk的磷酸化狀態，激活MAPK細胞內信號轉導途徑，調節細胞周期使處于G2期細胞數增多，調節細胞增殖分化。VEGF和GM-CSF干預放射后成纖維細胞，成纖維細胞增殖活力增強、凋亡減少、并促進細胞周期由G2/M向G1/S發展。本文初步研究了GM-CSF和VEGF對通路的激活情況，50 ng/ml VEGF組和GM-CSF組細胞的p-Akt和p-Erk較照射組明顯上調，這說明VEGF和GM-CSF在ADSCs修復放射后成纖維細胞過程中可能通過活化PI3K-Akt通路和MAPK通路發揮重要作用。PI3K/Akt信號通路和MAPK通路可被VEGF等各種細胞因子、生長因子激活，通過抑制角質形成細胞及成纖維細胞的凋亡，誘導新生血管形成，從而修復皮膚損傷[14]。綜上所述，ADSCs、VEGF與GM-CSF可有效促進細胞增殖，抑制細胞凋亡以及加速細胞周期，促進放射后成纖維細胞修復，為放射性皮膚損傷提供替代治療方法。由于實驗中VEGF和GM-CSF細胞因子用量遠大于ADSC的分泌量，且兩組Akt和Erk磷酸化效應弱于ADSCs共培養組。所以VEGF和GM-CSF可能只是參與放射性損傷修復細胞因子中的一部分。本次實驗不足之處在于沒有設置輻射后ADSCs對照組，無法直接證明VEGF和GM-CSF是ADSCs分泌。在下一步實驗設計上可以增加這一對照組以及逐步驗證ADSCs分泌的其他細胞因子在修復放射后成纖維細胞的作用，探討ADSCs修復放射性皮膚損傷的各種潛在機制。

ADSCs、VEGF與GM-CSF在治療放射性皮膚損傷時由于穩定性較差及半衰期較短，直接靜脈或局部注射會影響其活性及功能，且靜脈注射脂肪干細胞大部分會駐留在肺、肝、脾等臟器中，無法有效地將干細胞傳遞至損傷部位[15]。所以，合理利用載體穩定細胞因子的結構及提高干細胞的利用率，充分發揮它的生理功能是未來臨床研究的重點。最新研究表明，各種新興納米粒子支架材料已經廣泛用做ADSCs、VEGF等的載體，可為ADSCs的分化和增殖提供適合的微環境，以及穩定細胞因子的結構。已有研究表明，載VEGF殼聚糖納米粒子能夠使VEGF持久釋放，可以有效的治療大鼠放射性皮膚損傷[16]。體外釋藥研究結果表明，負載VEGF的溫敏凝膠可以持續釋放生長因子，促進大鼠全層皮膚創面愈合[17]。已有研究表明，磁靶向聚多巴胺修飾的脂肪間充質干細胞不僅可以維持間充質干細胞的各種生理功能，還可以定向歸巢至靶位修復損傷[18]。

綜上所述，ADSCs、VEGF與GM-CSF與載體或支架的新興結合方式將會是未來治療大面積皮膚創面的有效治療途徑，且不存在倫理學爭議，未來在臨床會成為更好的替代治療途徑。

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[收稿日期]2022-06-09

本文引用格式：尹小芳，秦嶺，楊超，等.ADSCs、VEGF和GM-CSF修復成纖維細胞放射性損傷的機制研究[J].中國美容醫學，2023，32（8）：29-34.