糖脂代謝體外模型研究進展

莊肯,郭娜,廖文君,袁華,孫銅,吳春勇*

(1.中國藥科大學藥物分析系,江蘇 南京 211198;2.濟南市食品藥品檢驗檢測中心,山東 濟南 250102;3.昆藥集團股份有限公司,云南 昆明 650106;4.山東省食品藥品檢驗研究院,山東 濟南 250101)

糖代謝主要包括糖的無氧氧化、有氧氧化、磷酸戊糖途徑、糖異生及糖原的合成與分解,是機體主要的供能途徑,也為脂質、蛋白質及核苷酸等生物大分子的合成提供原料。脂代謝是指人體攝入的脂肪經脂肪酶水解為游離脂肪酸和甘油而進入血液循環的過程,可為維生素、激素和細胞膜的合成提供原料,并參與機體內多種信號調節。糖代謝和脂代謝的關系復雜,糖代謝的氧化過程和磷酸戊糖途徑為脂質的合成提供能量及原料,而糖異生途徑則可利用脂代謝產物合成糖類,二者的動態平衡對于維持機體穩態至關重要(見圖1)[1]。

圖1 糖脂代謝總覽

隨著經濟發展,糖尿病、超重和肥胖等糖脂代謝紊亂性疾病嚴重威脅公共衛生安全[2]。由于發病機制復雜,相關藥物研發亟需合適的糖脂代謝模型。此外,腫瘤細胞在適宜環境下表現出的無限增殖特性,主要是通過糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)過程的相互轉換實現的[3],因此糖脂代謝模型研究對于腫瘤治療也有重要意義。動物模型可從整體層面研究生理狀態和不同疾病狀態下糖脂代謝的變化及相關藥物的治療作用[4],但模型構建難度大,存在種屬差異[5-6]。為此,各種體外研究模型應運而生。本文將對糖脂代謝體外研究常用的細胞及研究模型進行綜述,為后續糖脂代謝體外研究模型的開發和改進提供參考。

1 糖脂代謝體外研究常用細胞

1.1 肝細胞作為糖類和脂質等內源性物質合成、代謝、儲存和再分配的主要器官,以及藥物等外源性物質代謝的主要器官,肝臟是目前糖脂代謝機制研究及相關藥物篩選的主要研究器官。糖脂代謝體外研究常用的人肝細胞系主要有人原代肝細胞(primary human hepatocytes,PHH)、HepaRG細胞和HepG2細胞。PHH是肝臟體外代謝研究的金標準,在3D培養條件下,其體外代謝能力與體內條件相當,但獲取難度高、不易實現體外長期培養[7]。HepaRG細胞是衍生自PHH的終末分化細胞,具有與PHH相近的糖脂代謝和藥物代謝表達譜,但其獲取成本較高,體外3D長期培養條件較為復雜,通常需要額外添加L-谷氨酰胺和地塞米松等添加劑[8-9]。Samanez等[10]發現HepaRG細胞的糖酵解過程由葡萄糖濃度和胰島素水平共同調節,而脂肪生成途徑僅由胰島素調節,脂蛋白分泌主要受葡萄糖濃度影響。HepG2細胞獲取難度低,體外3D長期培養條件簡單,是體外糖脂代謝及藥物代謝研究使用最多的細胞系,但其體外代謝能力與PHH和HepaRG相比嚴重不足[11-12]。Boon等[13]發現細胞外的營養成分水平是細胞成熟度的主要決定因素,培養體系中加入超生理量的氨基酸可以提高HepG2細胞的葡萄糖敏感性,促進其線粒體功能形成,增強其糖脂代謝和藥物代謝能力。

1.2 腫瘤細胞腫瘤細胞在適宜環境下的無限增殖需要高效的能量生成,這主要是通過糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)過程的增強及相互轉換實現的,因此糖脂代謝研究對于癌癥治療有重要意義。Dai等[14]發現在人結直腸癌細胞系(HCT116和SW480等)和人結直腸癌臨床樣本中葡萄糖轉運體3(GLUT3)具有高表達水平,在生理條件(5 mmol·L-1葡萄糖)下GLUT3可通過增加葡萄糖攝取和促進核苷酸合成加速結直腸癌細胞生長,并增加結直腸癌細胞對維生素C的敏感性,可為臨床治療提供參考。Shen等[15]發現血小板型磷酸果糖激酶(PFKP)在人肺癌細胞系(H358和H827等)和人肺癌臨床樣本中高度表達,該酶可通過抑制糖酵解途徑減少肺癌細胞的葡萄糖攝取,進而抑制其增殖。

2 糖脂代謝體外2D模型

2D模型通常將細胞以單層形式進行平面培養,操作簡便、重復性好,但體內相似性不足。Nagarajan等[16]發現在2D條件下,HepG2細胞的葡萄糖攝取量是人體生理條件下的14倍,但糖原含量和葡萄糖氧化率僅有50%左右,葡萄糖產生量僅為30%左右,且上述結果均不受胰島素刺激影響,表明2D條件下HepG2細胞的糖代謝行為與人體生理條件相差較大。同時,Wei等[17]發現在2D條件下,HepG2細胞的24 h葡萄糖消耗量為5 μmol/106個細胞,PHH為20 μmol/106個細胞,而人體生理條件下可達133.2 μmol/106個細胞。Vinci等[18]發現在2D條件下,HepG2細胞的甘油含量為0.28 mmol·L-1/106個細胞,僅為人體生理條件的1.4%(20 mmol·L-1/106個細胞)。

3 糖脂代謝體外3D模型

3D模型是將細胞在具有不同3D結構的載體上或通過其他方式使其在3D立體空間中生長、遷移和分化的模型。相較于2D模型而言,3D模型中整個細胞表面都存在與其他細胞或基質的相互作用,細胞生長形態更加接近體內,可更加真實地反映體內情況[19]。目前應用于糖脂代謝體外研究的3D模型主要有細胞球樣體和器官芯片。

3.1 細胞球樣體細胞球樣體主要是細胞經懸滴培養、低黏附培養板培養、旋轉培養或利用細胞支架培養而自組裝形成的細胞聚集體,可更真實地模擬體內條件下的細胞-細胞、細胞-細胞外基質相互作用(見圖2a[20])。Balkrishna等[21]通過懸滴培養法構建了HepG2細胞球樣體非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型,該模型甘油含量可達16 mmol·L-1/106個細胞,與人體生理條件接近,且在糖尿病治療藥物吡格列酮的作用下,其甘油含量可降低至8 mmol·L-1/106個細胞,經處方藥利沃沙(Livogrit)治療后,該模型的谷草轉氨酶(AST)和谷胱甘肽(GSH)明顯下調至正常生理水平,發現了利沃沙有作為肝保護劑的潛力。Rousset等[22]通過懸滴培養法構建了人結直腸癌細胞(HCT116)球樣體,并結合電化學技術成功構建了葡萄糖氧化酶生物傳感器(見圖3),通過葡萄糖氧化酶(GOx)功能化水凝膠氧化葡萄糖,產生H2O2,測定H2O2濃度以反映葡萄糖濃度,實現了對細胞球樣體的葡萄糖動力學研究,發現形成球樣體后葡萄糖消耗更加迅速、消耗量更多,并建立了體外-體內外推(IVIVE)函數關系式,具有高度體內相關性。Pingitore等[23]通過低黏附培養板構建了由HepG2細胞和肝星狀細胞LX-2構成的共培養細胞球樣體NASH模型,將其暴露于游離脂肪酸環境中染色后可通過顯微鏡觀察到脂肪和膠原蛋白的積累,其分布情況與體內相似,且經NASH治療藥物利拉魯肽治療后,脂肪變性程度減少了50%。Tidwell等[24]利用低黏附培養板構建了人結直腸癌細胞(HCT116和SW948)球樣體,發現與2D條件相比,3D細胞球樣體的糖酵解作用更強,ATP生成量更多。Kurano等[25]利用旋轉培養法構建了HepG2細胞球樣體,2D條件下HepG2細胞分泌的載脂蛋白(Apo)含量為5 ng·mg-1,而該模型的Apo分泌量可達27 ng·mg-1,更加接近人體生理條件下的40 ng·mg-1。Smith等[26]利用旋轉培養法構建了人結直腸癌上皮細胞(DLD1)球樣體,發現處于“靜止”狀態(即暫停增殖狀態)的DLD1細胞代謝活性比增殖狀態更高,其葡萄糖和谷胱甘肽消耗量增加了2倍,乳酸分泌量增加了1.8倍,解釋了體內條件下觀察到的“靜止”狀態的腫瘤細胞的高代謝活性和腫瘤組織內部環境呈酸性的原因。Wei等[17]通過將半乳糖枝接在聚苯乙烯纖維上形成了一種全新的細胞支架,并以此構建了HepG2細胞球樣體,與2D條件相比,細胞球樣體的24 h葡萄糖消耗量和糖原含量均提高了近2倍,糖異生率、總膽固醇含量和甘油三酯含量提高了近3倍,更加接近人體生理水平,且對于激素和降糖降脂藥物更加敏感,可用于藥物篩選。

a.細胞球樣體;b.器官芯片

a.電化學裝置示意圖;b、c.檢測原理圖(GOx:葡萄糖氧化酶)

3.2 器官芯片器官芯片又稱“生物反應器”,是將細胞接種在主要以聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料的反應室中,借助微流控技術,通過機械作用將培養基以極低的流速持續灌注至反應室中以實現液體循環流動的裝置,可以模擬細胞在體內條件下受到的因液體流動而引起的機械作用(見圖2b[27])。Vinci等[28]構建了一個多室器官芯片,發現HepG2細胞與脂肪細胞、人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)共培養后,24 h葡萄糖消耗量提高了近8倍,達到79.6 μmol/106個細胞,接近人體生理水平。Tao等[29]利用人誘導性多能干細胞(hiPSCs)構建了人肝臟-胰島類器官芯片,共培養體系使肝細胞糖脂代謝相關酶和CYP450酶的基因表達量顯著提高,24 h葡萄糖消耗量提高了1.1倍,達到85 μmol/106個細胞,與人體生理水平相近,同時在高糖條件(25 mmol·L-1葡萄糖)下,肝細胞表現出線粒體功能障礙和葡萄糖轉運能力降低,通過二甲雙胍治療得到顯著改善。Kemas等[30]利用器官芯片進行了PHH的3D長期培養,發現每個PHH細胞球樣體的細胞數在3 000個以下時,球樣體的葡萄糖消耗量與細胞數呈正比例關系,同時利用該球樣體構建了胰島素抵抗(IR)模型,證明了肝臟特異性IR會導致脂肪生成和糖異生率增加,并揭示了IR是導致NASH的關鍵因素。Cipriano等[31]利用中空纖維式器官芯片對HepG2細胞進行了3D培養,與2D條件相比,3D條件下HepG2細胞的24 h葡萄糖消耗量提高了近5倍,達到66.7 μmol/106個細胞,同時CYP450酶和糖脂代謝相關酶的基因表達量也均有顯著提高,對于具有細胞毒性的雙氯芬酸也更加敏感,適合用于藥物篩選。

4 總結與展望

隨著糖尿病、超重和肥胖等糖脂代謝紊亂性疾病患病率逐年提高,糖脂代謝機制研究及相關藥物篩選的重要性不言而喻,對于具有高度體內相似性的糖脂代謝體外模型的需求愈發迫切。體外3D模型可以模擬細胞-細胞、細胞-細胞外基質的相互作用,相較于2D模型更加接近體內環境,同時通過多種細胞共培養,可進一步提高3D模型的體內相似性。但目前已構建的體外3D模型的糖脂代謝能力與體內條件相比仍有差距,模型構建技術、細胞培養條件和共培養體系還需進一步優化,相信在未來會出現更多種類的體外模型,在糖脂代謝機制研究及相關藥物篩選中發揮更重要的作用。