片仔癀對(duì)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠自噬和NLRP3炎癥小體活化的影響

許贊術(shù),譚耀龍,張慶,黃貞偉,鄭燕芳*,黃鳴清*

(1.福州市鼓樓區(qū)南街街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心,福建 福州 350001;2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院,廣東 東莞 523121;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)

急性肝損傷(acute liver injury,ALI)是一種在臨床上十分常見的肝臟疾病,由于肝細(xì)胞出現(xiàn)急性損傷或壞死而導(dǎo)致肝功能異常,其中部分患者還可出現(xiàn)肝衰竭[1-2]。炎癥反應(yīng)在急性肝損傷過程中扮演重要角色,其中NLRP3炎癥小體活化并介導(dǎo)IL-1β以及IL-18成熟和釋放是誘發(fā)急性肝損傷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致肝臟損傷的重要分子機(jī)制[3-4]。細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制,其通過自噬溶酶體清除胞內(nèi)受損或衰老的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器等,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。近年來,研究發(fā)現(xiàn)自噬與炎癥具有密切關(guān)聯(lián),一定程度上激活自噬可以抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),進(jìn)而緩解炎癥反應(yīng)帶來的組織損傷[5-6]。因此,通過調(diào)控自噬來緩解急性肝損傷具有重要的意義。

片仔癀(Pien-Tze-Huang,PTH)是我國(guó)一種保密級(jí)的中成藥,由珍貴藥材麝香、蛇膽、牛黃以及三七等精制而成,具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的功效,尤其對(duì)急慢性病毒肝炎等炎癥性疾病具有很好的療效[7-8],而且實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)PTH可通過促進(jìn)自噬抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥以緩解腦卒中損傷[9]。但是,目前關(guān)于片仔癀對(duì)急性肝損傷的作用及可能機(jī)制的研究少有報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)通過酒精建立急性肝損傷模型并給予PTH,觀察片仔癀對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用,并初步明確其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)別健康雄性C57BL/6小鼠30只(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司,生產(chǎn)許可證:SCXK(浙)2019-2020,小鼠體質(zhì)量為(20±2)g,小鼠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證:SYXK(閩)2019-0007],一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究通過福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵循動(dòng)物福利相關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑片仔癀(漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):2107105);酒精;谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,C010-2-1);谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,C009-2-1);甘油三酯測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所,A110-1-1);HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,G1120);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛,K1691);擴(kuò)增試劑盒(賽默飛,A35495);一抗NLRP3(CST,15101)、Caspase-1 p20(CST,89332)、IL-18(CST,57058)、Beclin1(CST,3495)、LC3(CST,4599);二抗β-actin(CST,3700)和GAPDH(CST,5174)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器倒置熒光顯微鏡(德國(guó)徠卡公司,DMi8);生物組織包埋機(jī)(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司,YB-6LF);生物組織脫水機(jī)(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司,TS-12D);生物組織攤烤機(jī)(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司,YT-7FB);石蠟切片機(jī)(美國(guó)賽默飛公司,HM325);Power PAC Basic電泳儀(Bio-Rad,1645050);Mini PROTEAT Tetra垂直電泳槽(Bio-Rad,1658001);Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad,170-3930);ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad,1708265)。

2 方法

2.1 藥物配置首先將片仔癀研磨成粉末,稱取適量并加入2%吐溫-80,制備成濃度分別為7.5、15、30 g·mL-1的混懸液備用;將適量酒精溶于蒸餾水中,配制成50%酒精溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

2.2 動(dòng)物分組及給藥將30只SPF級(jí)雄性C57BL/5小鼠隨機(jī)分為5組(每組6只):空白組(Control)、模型組(酒精)、PTH低劑量組(75 mg·kg-1)、PTH中劑量組(150 mg·kg-1)和PTH高劑量組(300 mg·kg-1),連續(xù)灌胃給藥3 d(2次/天)。空白組灌胃給予相應(yīng)體積的蒸餾水。末次給藥2 h后,模型組、PTH低、中、高劑量組灌胃50%的乙醇(0.12 mL/10 g),空白組灌胃相應(yīng)體積的蒸餾水。造模后禁食不禁水,于24 h后取血和肝臟等。

2.3 AST、ALT和TG檢測(cè)造模24 h后,小鼠摘眼球取血,室溫靜置1 h,然后于4 ℃離心機(jī)中離心10 min,轉(zhuǎn)速為3 200 r·min-1,之后吸取上層血清至新的無菌EP管中,按照試劑盒說明書分別測(cè)量血清中AST、ALT和TG的含量水平。

2.4 蘇木素-伊紅染色頸椎脫臼法處死小鼠,剝離肝臟,然后用預(yù)冷PBS沖洗表面殘留血液,取部分肝組織(0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm)固定。然后肝臟組織進(jìn)行脫水透明、石蠟包埋與切片、切片脫蠟及復(fù)水,之后進(jìn)行HE染色,再脫水封片,最后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織病理變化,并于200倍鏡下拍攝代表區(qū)域。

2.5 qRT-PCR檢測(cè)炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平小鼠處死后取肝臟組織,轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的研缽中研磨成粉,稱取100 mg組織粉末,加入1 mL RNA提取劑,用2.5 mL注射器的針筒配合1 mL注射器的針頭在冰上反復(fù)抽提,直至無明顯組織塊,于冰上靜置15 min。離心取上清300 μL,并加入等體積異丙醇沉淀總RNA,之后用預(yù)冷75%乙醇洗滌兩次,室溫晾干后加入60 μL滅菌水并測(cè)濃度,反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA,然后進(jìn)行擴(kuò)增(見表1)。目的基因相對(duì)含量=2-ΔΔCt,ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)-對(duì)照組ΔCt(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)。

表1 IL-6、IL-1β、TNF-α和GAPDH引物序列

2.6 Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平取部分新鮮肝組織放入玻璃勻漿器中,加入2 mL含1%蛋白磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解液,于冰上研磨至無明顯組織塊。靜置30 min,收集組織液于預(yù)冷無菌EP管中,在4 ℃離心機(jī)中離心10 min,轉(zhuǎn)速為14 000 r·min-1,后收集上清液并測(cè)濃度。然后加入5倍量蛋白上樣緩沖液,并置于蛋白變性儀中變性,條件為100 ℃,15 min。然后上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉,之后孵育一抗NLRP3、Caspase-1 p20、IL-18,Beclin1、LC3,4 ℃過夜,然后孵育二抗鼠或兔,最后ECL化學(xué)發(fā)光成像并保存圖像,用Image Lab 6.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果

3.1 片仔癀對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組血清中ALT、AST和TG水平均明顯升高,表明酒精刺激后,出現(xiàn)了急性肝損傷,肝臟功能受損(P<0.01);與模型組相比,給藥組中ALT、AST和TG表達(dá)水平明顯下降,表明PTH可緩解酒精導(dǎo)致的小鼠肝臟急性損傷(P<0.05、P<0.01),結(jié)果見圖1。

圖1 PTH對(duì)酒精誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清中AST、ALT、TG含量的結(jié)果

3.2 PTH對(duì)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響HE染色結(jié)果顯示,空白組肝組織細(xì)胞排列整齊且肝小葉結(jié)構(gòu)完整,中央靜脈無擴(kuò)張,門靜脈區(qū)無變性、壞死以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂,未見明顯的肝小葉結(jié)構(gòu),肝竇有充血現(xiàn)象,中央靜脈可見明顯淤血擴(kuò)張且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),表明肝臟組織受到嚴(yán)重?fù)p傷。與模型組相比,片仔癀組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較為完整,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,中央靜脈淤血擴(kuò)張明顯緩解,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較完整,表明PTH可修復(fù)酒精誘導(dǎo)的肝臟組織病理?yè)p傷,結(jié)果見圖2。

圖2 PTH對(duì)酒精誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響(×200)

3.3 PTH對(duì)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)水平的影響qRT-PCR結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組小鼠肝組織中IL-6、TNF-α和IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯上身,表明酒精導(dǎo)致了肝臟組織炎癥反應(yīng)(P<0.01)。與模型組相比,PTH組小鼠肝組織中IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA水平明顯下降,且呈現(xiàn)濃度依賴性,表明PTH可顯著抑制炎癥反應(yīng)(P<0.05、P<0.01),結(jié)果見圖3。

3.4 PTH對(duì)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Western blot結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組小鼠肝組織中NLRP3、Caspase-1 p20和IL-18蛋白水平明顯上升,表明NLRP3炎癥小體活化(P<0.01);與模型組相比,PTH組小鼠肝臟組織中NLRP3、Caspase-1 p20和IL-18蛋白水平明顯下降,表明PTH可抑制NLRP3炎癥小體活化(P<0.05、P<0.01),結(jié)果見圖4。

圖4 PTH對(duì)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟中NLRP3、Caspase-1 p20和IL-18蛋白表達(dá)影響

3.5 PTH對(duì)酒精誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠肝組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Western blot結(jié)果表明,與空白組相比,模型組肝組織中蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以及Beclin1蛋白水平均增加(P<0.01),表明酒精干預(yù)后自噬水平下降;與模型組相比,給藥組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin1的蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05或P<0.01),表明PTH可促進(jìn)自噬,結(jié)果見圖5。

圖5 PTH對(duì)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟組織中Beclin1和LC3蛋白水平的影響

4 討論

酒精是一種常見的肝臟毒性物質(zhì),可導(dǎo)致酒精性急性肝損傷,常用于構(gòu)建急性肝損傷模型。小鼠灌胃酒精后,血液中AST、ALT和TG等水平會(huì)明顯增加,肝臟組織出現(xiàn)病理?yè)p傷等[1,10]。本研究灌胃酒精建立急性肝損傷模型并給予PTH進(jìn)行干預(yù),觀察PTH對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組血液中AST、ALT和TG明顯升高,HE結(jié)果顯示模型組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,未見明顯的肝小葉結(jié)構(gòu)區(qū)域,肝竇有充血現(xiàn)象,且中央靜脈可見淤血擴(kuò)張,肝索排列紊亂,有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。表明酒精誘導(dǎo)了大鼠急性肝損傷。與模型組相比,給藥組小鼠血液中AST、ALT和TG水平明顯下降,且肝組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂現(xiàn)象明顯改善,表明PTH可以緩解酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷。

NLRP3炎癥小體是一種蛋白復(fù)合體,由受體蛋白NLRP3、接頭蛋白ASC以及效應(yīng)蛋白Caspase-1 p20組成,炎癥發(fā)生后活化的NLRP3炎癥小體可切割pro-IL-1β和pro-IL-18為成熟的IL-1β和IL-18,進(jìn)而介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11]。本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)肝臟組織內(nèi)相關(guān)炎癥因子的mRNA以及NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白水平。PCR結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA水平明顯上升,表明急性肝損傷后炎癥反應(yīng)激活;與模型組相比,PTH組中IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA水平顯著下降,表明PTH可抑制炎癥反應(yīng)。Western blot結(jié)果顯示,與空組相比,模型組NLRP3、Caspase-1 p20和IL-18蛋白水平明顯增加,表明模型組NLPR3炎癥小體被活化;與模型組相比,PTH組NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)明顯下降,表明PTH可以顯著抑制酒精誘導(dǎo)急性肝損傷中NLRP3炎癥小體活化,進(jìn)而抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

細(xì)胞自噬與NLRP3炎癥小體之間具有密切關(guān)系,自噬可以調(diào)控NLRP3炎癥小體的活化,故其在抑制炎癥反應(yīng)中具有重要意義。Beclin1和LC3是自噬相關(guān)蛋白,在自噬溶酶體形成中發(fā)揮重要作用,是反應(yīng)自噬水平的關(guān)鍵指標(biāo)[12-13]。Western blot結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組中Beclin1蛋白表達(dá)水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上均下降,表明模型組自噬水平降低;與模型組相比,PTH組Beclin1蛋白表達(dá)水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯上升,表明PTH可顯著促進(jìn)自噬。

綜上所述,片仔癀可能通過調(diào)控自噬通路來抑制NLRP3炎癥小體活化以及炎癥因子等釋放,從而抑制酒精誘導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終發(fā)揮改善急性肝損傷的作用。但是,本研究未探究PTH調(diào)控自噬的具體通路,后續(xù)實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步闡明PTH作用機(jī)制。