達格列凈對大鼠造影劑腎病的保護作用及機制

李依陽,鄺日禹,張濤,蘇曉琳,曾鳳蘭,雷玲艷,潘曉芬

(1.廣西壯族自治區民族醫院,廣西 南寧 530001;2.聯勤保障部隊第923醫院,廣西 南寧 530021)

隨著含碘造影劑在臨床上愈加廣泛的運用,造影劑腎病(CIN)現已成為第三位最常見的醫院獲得性急性腎損傷[1]。臨床上使用較多的診斷標準是:血肌酐水平在造影劑暴露后24～48 h增加≥25%或較其基礎值升高≥0.5 mg·dL-1[2-3]。CIN的發生將導致醫療費用增加、入院時間延長,增加病痛甚至死亡風險,嚴重影響患者的生存質量[4]。目前CIN的發病機制仍不清楚,亦無有效的治療方法,多年來研究者試圖通過更換造影劑種類、水化治療及使用N-乙酰半胱氨酸治療等措施仍未能有效阻止CIN的發生,且各種措施亦存在爭議[5]。研究如何減少造影劑造成的腎損害,尋找有效的防治措施具有非常重要的臨床意義。研究表明使用達格列凈可明顯改善患者血糖控制水平和腎臟功能[6-7]。本實驗主要觀察達格列凈對造影劑誘導的急性腎損傷模型大鼠是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠,雄性,SPF級,體重180～220 g,斯貝福(北京)生物技術有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2019-0010。動物飼養環境溫度20～25 ℃,濕度40%～60%。動物實驗經廣西民族醫院倫理委員會批準,動物實驗倫理審查證書編號:桂民醫倫審通字〔2022〕42號。

1.2 藥物與試劑達格列凈(阿斯利康制藥有限公司分裝);吲哚美辛(上海麥克林生化科技股份有限公司);左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME,上海麥克林生化科技股份有限公司);碘海醇注射液(拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司);Cr、BUN、SOD、MDA測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);DAPI染色液(武漢博士德公司);Nrf2、HO-1抗體(美國Affinity BioReagents);熒光二抗(北京中杉金橋公司)。

1.3 儀器Multiskan Sky全波長酶標儀(美國Thermo Fisher 公司);UC90奧林巴斯成像系統(日本Olympus公司);BX43奧林巴斯熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 建立動物模型SD大鼠隨機分為正常組、模型組、達格列凈組,每組 6只。各組大鼠禁水24 h、禁食過夜后,給予模型組、達格列凈組尾靜脈注射吲哚美辛(10 mg·kg-1),15 min 后尾靜脈注射L-NAME (10 mg·kg-1),再 15 min 后尾靜脈注射碘海醇(1 600 mg·kg-1)[6]。給予正常組尾靜脈注射生理鹽水3次,每次間隔15 min,給藥體積10 mL·kg-1。達格列凈組于造模前2 h灌胃給予達格列凈(參考文獻用量[8]1 mg·kg-1,生理鹽水溶解,濃度0.1 mg·mL-1)。正常組、模型組灌胃給予等體積生理鹽水。造模完成后放入代謝籠留取24 h尿液。血肌酐水平在造影劑暴露后24～48 h增加≥25%或較其基礎值升高≥0.5 mg·dL-1[2-3],則提示造模成功。

1.5 大鼠腎功能指標檢測造模后24 h,腹主動脈取血并分離血清,按試劑盒方法測定Scr和BUN含量;采血后冰浴上迅速取兩腎,一側用10%福爾馬林固定,另一側用濾紙吸干水分后放-80 ℃冰箱中保存待用。收集不同實驗組24 h尿液,測定24 h尿量、Ucr含量,計算肌酐清除率,肌酐清除率=(Ucr×24 h尿量)/(Scr×24×60×體重)。

1.6 腎組織SOD、MDA的檢測 制備腎組織勻漿,3 000 r·min-1離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明書步驟進行蛋白、SOD、MDA含量檢測。

1.7 HE染色觀察腎組織病理學改變腎組織固定后常規石蠟包埋、切片、HE染色,光學顯微鏡下觀察。

1.8 腎組織Nrf2、HO-1免疫熒光染色腎組織固定后脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟至水,抗原熱修復,封閉,孵育Nrf2、HO-1抗體(稀釋比例為1∶100)、熒光二抗(稀釋比例為1∶200),DAPI 染核,封片,熒光顯微鏡下觀察照相,Image J 軟件分析并計算平均光密度值。

1.9 統計學方法數據應用SPSS 22.0軟件進行方差分析。

2 結果

2.1 達格列凈對CIN大鼠腎功能指標的影響模型組Scr、BUN、Ucr含量較正常組顯著增加(P<0.05或P<0.01),肌酐清除率顯著下降(P<0.01);達格列凈組Scr、BUN含量與模型組比較顯著降低(P<0.01),肌酐清除率與模型組比較顯著提高(P<0.05),結果見表1。

表1 達格列凈對CIN大鼠腎功能指標的影響

2.2 達格列凈對CIN大鼠腎組織SOD、MDA的影響 模型組腎組織SOD含量較正常組顯著下降、MDA含量較正常組顯著升高(P<0.01);達格列凈組腎組織SOD含量較模型組顯著升高、MDA含量較模型組顯著下降(P<0.05),結果見表2。

表2 達格列凈對CIN大鼠腎組織 SOD、MDA的影響

2.3 達格列凈對CIN大鼠腎組織病理損傷的影響正常組大鼠腎小管結構正常,上皮細胞完整,無變性壞死;模型組大鼠腎小管上皮細胞空泡樣變性、壞死;達格列凈組大鼠腎小管上皮細胞空泡樣變區域明顯減少,結構相對完整。

2.4 達格列凈對CIN大鼠腎組織Nrf2、HO-1表達的影響HO-1、Nrf2主要在腎小管細胞表達,造影劑腎損傷后皮質和髓質的小管細胞 HO-1、Nrf2表達均有輕度代償性升高,達格列凈干預后其表達量在皮髓質均進一步明顯增多(與模型組比較P<0.01),結果見圖2、表3。

圖2 免疫熒光染色法觀察各組腎組織Nrf2、HO-1表達情況(×200)

圖2 各組腎組織病理損傷情況(HE,×200)

表3 達格列凈對CIN大鼠腎組織Nrf2、HO-1表達的影響

3 討論

隨著影像技術及造影技術的發展,CIN的發生也呈現上升趨勢。如何有效預防、治療CIN已成為臨床急需解決的問題。本實驗運用吲哚美辛、L-NAME及碘海醇復制了CIN大鼠模型,結果顯示造模后 24 h Scr較正常大鼠翻倍,提示造模成功。預防性給予達格列凈后,Scr、BUN含量顯著降低,肌酐清除率顯著提高,病理結果顯示達格列凈組大鼠腎小管上皮細胞變性區域明顯減少,表明達格列凈對CIN具有一定的保護作用。

研究認為CIN的發生機制主要是腎髓質缺氧、氧化應激、腎小管上皮細胞和血管內皮細胞損傷及造影劑的毒性作用等[9]。正常機體存在著氧化與抗氧化的動態平衡,當體內大量的自由基無法清除,就會導致氧化應激與抗氧化平衡失調,引起細胞膜過氧化反應,從而引發疾病。SOD 能清除超氧陰離子自由基而保護細胞免受損傷,SOD活性的高低提示機體抗氧化能力的高低[10],造影劑能夠減弱腎臟SOD的活性,導致氧自由基的產生增加,從而導致腎小管的損傷[11]。MDA是脂質過氧化過程中主要生成的一種醛類物質,MDA的含量可間接反映體內的脂質過氧化程度[12]。本研究結果發現,使用達格列凈后,大鼠腎組織MDA降低,SOD活性升高,腎功能得到改善。據此,推斷達格列凈對CIN的保護機制可能通過抗氧化應激發揮作用。

大量研究表明Nrf2/HO-1通路是機體不可缺少的內源性保護系統,參與各種急慢性氧化應激的調節[13]。Nrf2是細胞氧化應激反應中的關鍵因子,當受到氧化應激信號刺激時,Nrf2與Kelch樣ECH關聯蛋白1(Keap1)解離,與抗氧化反應元件(ARE)ARE結合,激活Nrf2/ARE信號轉導通路,啟動受ARE調控的下游一系列靶基因(如HO-1等)的轉錄及表達,增強細胞的抗氧化應激能力[14-15]。HO-1是血紅素代謝過程中的重要酶,具有抗氧化、抗炎的作用[16]。正常條件下,HO-1的含量與活性均處于較低水平,當機體受到低氧或者其他刺激處于應激狀態時,機體可通過Nrf2/ARE通路啟動HO-1表達,發揮抗氧化作用[15]。本實驗結果表明達格列凈可升高Nrf2、HO-l蛋白的表達,可能通過Nrf2/HO-1通路提高了大鼠抗氧化應激能力從而發揮腎保護作用。

綜上,達格列凈可以改善CIN模型大鼠腎功能,具有腎保護作用,這可能與達格列凈提高大鼠抗氧化應激能力有關,但具體的作用機制尚需進一步探索研究。