LC-MS/MS法測定替諾福韋前體藥物中遺傳毒性雜質(zhì)

張連義,郭常川,文松松,陳真,李琳,徐玉文

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省仿制藥一致性評價(jià)工程技術(shù)研究中心,產(chǎn)業(yè)技術(shù)基礎(chǔ)公共服務(wù)平臺,山東 濟(jì)南 250101)

富馬酸替諾福韋二吡呋酯(以下簡稱:TDF)是美國Gilead Sciences公司研制的一種單磷酸腺苷的類似物,在體內(nèi)發(fā)生酯基水解轉(zhuǎn)化為替諾福韋。隨后經(jīng)細(xì)胞酶磷酸化為替諾福韋二磷酸鹽,通過與天然底物去氧腺苷5′-三磷酸鹽競爭,抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶和HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性,并與病毒DNA融合,終止DNA鏈延伸,用于治療HIV-1和慢性乙型肝炎[1-2]。原研品種為片劑,2008年獲得藥品進(jìn)口注冊證書,國內(nèi)仿制制劑有二十余家,絕大多數(shù)劑型為片劑,少數(shù)為顆粒劑和膠囊劑。

TDF合成路線較長,其中環(huán)氧丙烷或者(R)-1,2亞丙基碳酸酯與腺嘌呤縮合得到替諾福韋酯中間體(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤,進(jìn)一步脫水生成9-丙烯基腺嘌呤[3-5],結(jié)構(gòu)式見圖1。通過使用毒性評價(jià)工具Toxtree軟件(3.1.0版,以Development of Structural Alerts for theinvivoMicronucleus Assay in Rodents為決策樹)進(jìn)行評估,顯示該結(jié)構(gòu)中至少含有1個(gè)基因警示結(jié)構(gòu)。國際藥典[6]和USP官網(wǎng)公布的富馬酸替諾福韋二吡呋酯草案規(guī)定9-丙烯基腺嘌呤限度為0.0005%(5 ppm)。質(zhì)譜法由于其靈敏度高、專屬性好等優(yōu)點(diǎn),多應(yīng)用于遺傳毒性雜質(zhì)等痕量物質(zhì)檢測[7-8],目前文獻(xiàn)報(bào)道9-丙烯基腺嘌呤的檢測多采用LC-MS法[9-12],但已報(bào)道文獻(xiàn)均存在一定的局限性,存在選擇性較差、儀器要求高、方法驗(yàn)證不全面等缺點(diǎn)。有文獻(xiàn)采用分散液-液微萃取結(jié)合HPLC法測定[13],但是前處理步驟較為繁瑣。本文參考ICH指導(dǎo)原則M7(R1)[14]和《中國藥典》2020年版(四部)附錄9306遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則[15],采用LC-MS/MS法測定TDF原料藥和片劑中該雜質(zhì)含量,并分析了最小二乘法中不加權(quán)和加權(quán)兩種線性擬合結(jié)果的準(zhǔn)確度。

圖1 9-丙烯基腺嘌呤雜質(zhì)結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀[安捷倫科技(中國)有限公司];CP225D型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)公司]。

1.2 試藥TDF原料藥:YZ202201669、YZ202201670、YZ202201671、YW202202930、YW202202931,企業(yè)委托樣品;TDF片:YW202201959、YW202201960、YW202201961,企業(yè)委托樣品;9-丙烯基腺嘌呤對照品批號:R131T1,98%,USP;TDF對照品:101295-201901,99.4%,中檢院。

甲醇(色譜純,德國默克公司),超純水(超純水機(jī),美國Millipore公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜質(zhì)譜條件色譜柱:Waters XBridge C18(4.6 mm×150 mm,3.5 μm);以甲醇-水(55∶45)為流動相,等度洗脫8 min(2.0～2.6 min進(jìn)質(zhì)譜),流速:1.0 mL·min-1,進(jìn)樣體積:2 μL,柱溫40 ℃。采用正離子電噴霧(ESI+)模式電離,多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)模式,正離子掃描方式檢測,Fragmentor電壓:100 V,碰撞能CE:20 V,鞘氣溫度:200 ℃,毛細(xì)管電壓:4 000 V,檢測離子通道為m/z:176.0→136.0。

2.2 溶液制備對照品貯備溶液:精密稱取9-丙烯基腺嘌呤對照品適量,加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.05 μg的溶液。

對照品溶液:精密量取對照品貯備溶液適量,用甲醇定量稀釋制成每1 mL中約含0.005 μg的溶液。

原料藥供試品溶液:精密稱取原料藥適量,加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液。

片劑供試品溶液:精密稱取本品20片,研細(xì),精密稱取細(xì)粉適量,加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液。用微孔濾膜(0.45 μm)濾過,取續(xù)濾液。

2.3 專屬性試驗(yàn)取空白溶劑(甲醇),對照品溶液、TDF對照品溶液,分別進(jìn)樣測定,9-丙烯基腺嘌呤出峰時(shí)間為2.24 min,替諾福韋出峰時(shí)間為3.19 min,相同保留時(shí)間處,空白溶劑和供試品溶液對9-丙烯基腺嘌呤測定無干擾,方法專屬性良好。專屬性試驗(yàn)圖譜見圖2。

A.TDF對照品溶液;B.丙烯基腺嘌呤對照品溶液;C.空白溶液

2.4 儀器精密度取對照品限度濃度溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算各雜質(zhì)峰面積的RSD值為1.1%,表明儀器精密度良好。

2.5 線性關(guān)系考察精密量取對照品貯備溶液,分別定量稀釋制成0.125、0.5、1、2.5、4、5、6、7.5、25 ng·mL-1的溶液,分別進(jìn)樣測定。以9-丙烯基腺嘌呤質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),m/z 176.0→136.0離子對峰面積為縱坐標(biāo),以最小二乘法線性擬合[16],建立回歸方程,并計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r)。結(jié)果表明,9-丙烯基腺嘌呤在0.051～25.250 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,未加權(quán)線性回歸方程為Y=2 006.34X-131.47,相關(guān)系數(shù)r=1.000 0。對各濃度點(diǎn)應(yīng)用適當(dāng)?shù)臋?quán)重因子,加大低濃度點(diǎn)的權(quán)重[17-18]。以1/X2為權(quán)重系數(shù),加權(quán)后得到線性回歸方程為Y=1 954.29X+6.11,相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。

2.6 定量限與檢出限取對照品溶液,用溶劑逐級依次稀釋,分別進(jìn)樣。按S/N≥10計(jì)算定量限,按S/N≥3計(jì)算檢出限。結(jié)果表明,方法的定量限為0.051 ng·mL-1,檢出限為0.017 ng·mL-1。

2.7 準(zhǔn)確度與重復(fù)性考察考察高、中、低3個(gè)濃度的9-丙烯基腺嘌呤在TDF原料藥及片劑中的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。精密稱取TDF原料藥和制劑9份,分別精密加入高、中、低水平各3份,加溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,進(jìn)樣測定,按外標(biāo)法計(jì)算9-丙烯基腺嘌呤回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。片劑同法測定,結(jié)果見表1。3個(gè)加標(biāo)濃度下,9-丙烯基腺嘌呤在原料藥中平均回收率為99.08%～99.97%,RSD為0.6%～1.3%;片劑中平均回收率為98.94%～101.96%,RSD為0.2%～0.3%;表明本方法的準(zhǔn)確度回收率和重復(fù)性良好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性將對照品溶液保存于進(jìn)樣瓶中,在自動進(jìn)樣器中按照試驗(yàn)條件放置0、8、12、24 h后進(jìn)樣測定,記錄色譜圖和峰面積。結(jié)果顯示,9-丙烯基腺嘌呤峰面積的RSD為2.3%,說明該條件下9-丙烯基腺嘌呤在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 耐用性分別調(diào)整柱溫為38、42 ℃,流動相流速分別調(diào)整為0.98、1.02 mL·min-1。結(jié)果表明,9-丙烯基腺嘌呤的色譜圖峰型無變化,保留時(shí)間偏差在-2.08%～1.95%和峰面積偏差在-3.70%～1.07%,表明檢測條件輕微改變不影響9-丙烯基腺嘌呤的測定,方法耐用性良好。

2.10 樣品測定取3批TDF原料藥及制劑,照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別進(jìn)樣測定,記錄色譜圖和峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算9-丙烯基腺嘌呤含量,結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 最小二乘法不同線性擬合結(jié)果準(zhǔn)確度由擬合得到的線性方程可知,未加權(quán)線性擬合的截距比加權(quán)線性擬合大,表示在低濃度區(qū)域未加權(quán)線性擬合的準(zhǔn)確度差于加權(quán)線性擬合。

對線性關(guān)系中得到的未加權(quán)線性擬合方程和加權(quán)線性擬合方程,將峰面積回代入公式中,求得該點(diǎn)的濃度值,并計(jì)算相對誤差。數(shù)據(jù)見表3。使用未加權(quán)線性擬合,在低濃度區(qū)域尤其是濃度低于1 ng·mL-1的點(diǎn)分析結(jié)果相對誤差分別為10.30%、131.37%,超出了可接受范圍。以加權(quán)線性擬合,在低濃度區(qū)域相同濃度分析結(jié)果相對誤差分別為-0.79%、0.00%。與上述根據(jù)截距推論得到的結(jié)論一致。雖然在高濃度區(qū)域5～25 μg·mL-1,加權(quán)線性擬合測得數(shù)據(jù)的相對誤差比未加權(quán)線性擬合的相對誤差大,但均小于2.5%。加權(quán)線性擬合在整個(gè)線性濃度范圍測定結(jié)果與理論值相對偏差比較均衡,均能取得可接受的結(jié)果,數(shù)據(jù)可靠性更高。如果線性濃度范圍繼續(xù)增大,由于在低濃度點(diǎn)加權(quán)過重,導(dǎo)致高濃度點(diǎn)的測量準(zhǔn)確度下降。

表3 未加權(quán)線性擬合與加權(quán)線性擬合數(shù)據(jù)對比

表4 不同方法樣品測定結(jié)果(ng·mL-1)

3.2 不同方法樣品測定結(jié)果分析以外標(biāo)法、未加權(quán)線性擬合、加權(quán)線性擬合分別對陽性樣品的測得結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。由于濃度值非常小,在定量限附近,加權(quán)線性擬合的測定結(jié)果更為準(zhǔn)確。外標(biāo)法測得結(jié)果與加權(quán)線性擬合結(jié)果較為接近。外標(biāo)法在日常檢驗(yàn)中作為常用的檢測方法,能取得準(zhǔn)確的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究建立了TDF原料藥和片劑中9-丙烯基腺嘌呤的LC-MS/MS法檢測方法,進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證并將方法用于TDF原料藥及片劑中9-丙烯基腺嘌呤含量的測定。以最小二乘法進(jìn)行線性擬合,加權(quán)線性擬合在限度以下的低濃度區(qū)域準(zhǔn)確度更高,優(yōu)于未加權(quán)線性擬合。本方法靈敏度高、專屬性好、回收率高、線性范圍寬,操作簡便、快速,能夠滿足痕量基因毒性雜質(zhì)的檢測要求。