基于HPLC-CAD的參麥顆粒中糖含量與色度值的相關性分析及糖攝入量評估

雷蓉,劉亞茹,蘇建,劉永利,

(1.河北省藥品醫療器械檢驗研究院,河北省中藥質量評價與標準研究重點實驗室,河北 石家莊 050227;2.河北醫科大學,河北 石家莊 050017)

參麥顆粒收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第十三冊,是由紅參、南沙參、麥冬、黃精、山藥和枸杞子六味藥材提取濃縮成清膏加輔料蔗糖920 g制粒而成,具有養陰生津的功效,用于食欲不振、神經衰弱等癥狀,臨床上可以用于治療心悸氣短[1-2]。蔗糖屬于雙糖,是由一分子果糖和一分子葡萄糖脫水縮合而成,在高溫情況下,蔗糖會分解產生果糖和葡萄糖,并形成一種焦糖色素復雜的混合型化合物,造成顏色的變化[3]。色澤作為一種外觀特征,在中藥材質量評價方面發揮著重要作用,因此本研究通過色澤評價配方顆粒的質量。通過眼睛觀察判別顏色的傳統手段存在嚴重不足,易受人為影響,而將顏色進行量化的儀器客觀性更強,可以很好地彌補這一缺點[4-6],電噴霧檢測器(CAD)適用于檢測不揮發或者半揮發性成分,本研究采用高效液相色譜串聯電噴霧檢測器(HPLC-CAD)測定參麥顆粒中糖類成分[7]。市售的參麥顆粒來源于3個廠家,研究發現不同廠家參麥顆粒顏色差異較大,經調研,3家企業生產工藝中制粒溫度稍有差異,因此運用Lab色彩模式對其進行色澤分析,并且將色度值(L*、a*、b*)與糖類成分含量進行結合分析,探究參麥顆粒的顏色與糖類含量的內在關系?，F已有多項研究通過色澤來預測中藥材中化學成分含量的高低,有研究表明,根據金銀花顏色指標預測其所含總黃酮類成分質控含量的方法可行[8],可通過蒸制過程中何首烏顏色變化預測二苯乙烯苷、蒽醌類成分的含量[9]。

參麥顆粒所含輔料蔗糖主要用于改善味道,以矯味劑和填充劑的作用而存在。但糖攝入過多會對身體造成危害,因此有必要控制輔料蔗糖的投入量。目前有關游離糖的控制已廣泛滲透到食品行業,世界衛生組織以及《中國食品膳食指南(2022)》中均對食品中的游離糖進行了控制,但藥品方面相關的政策法規尚不完善,因此本文章參考食品中游離糖的控制限度,通過計算參麥顆粒中游離糖的含量進而對每日糖攝入量進行評估,為科學指導患者健康提供了新的思路,為參麥顆粒的進一步研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國Thermo公司);XPE26 型電子天平(0.001 mg)、XS105DU 型電子天平(0.01 mg)均購于瑞士Mettler-Toledo公司;KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);超純水系統(Milli-Q,美國Millipore公司)。

1.2 材料果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖對照品(批號依次為100231-202008、110833-202109、111507-202105,質量分數依次為99.9%、99.9%、99.8%,中國食品藥品檢定研究院);乙腈為色譜純;水為超純水。

30批次參麥顆粒樣品抽自全國各地經營、使用單位,涉及3個廠家,其中A廠家樣品10批次(S1～S10),B廠家樣品10批次(S11～S20),C廠家樣品10批(S21～S30)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱為GRACE Prevail Carbohydrate ES柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈為流動相A,水為流動相B,梯度洗脫(0～20 min,75%A;20～25 min,75%～90%A);柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL·min-1;進樣體積為1 μL;CAD檢測器參數:霧化溫度35 ℃,冪率1.6,采樣頻率10 Hz。HPLC-CAD色譜圖見圖1。

1.果糖;2.葡萄糖;3.蔗糖

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液精密稱取各對照品適量,加水制成果糖、葡萄糖、蔗糖的濃度分別為0.896、0.221、50.479 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取參麥顆粒樣品粉末約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入10 mL水,密塞,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)15 min,放冷,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察取混合對照品溶液1、0.5、0.2、0.1 mL,加水定容至5 mL,得到不同濃度的稀釋液,將混合對照溶液及其稀釋液進樣測定。以對照品溶液的濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,計算回歸方程,結果見表1。

表1 參麥顆粒中3個糖類成分的線性關系考察結果

2.3.2 精密度試驗取混合對照溶液,按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次,記錄果糖、葡萄糖、蔗糖的峰面積,結果表明,相對峰面積的RSD分別為1.8%、3.5%、3.8%,表明方法的重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗取供試品溶液(S30),分別于0、2、4、6、8、12、24 h時進樣測定,記錄峰面積進行計算,得到果糖、葡萄糖、蔗糖的峰面積的RSD分別為1.7%、2.3%、2.6%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗取參麥顆粒粉末(S30),按“2.2.2”項下方法制備低、中、高3個濃度的樣品,每個濃度平行制備3份,按“2.1”項下色譜條件分別進樣,記錄色譜圖。結果表明各色譜峰的相對保留時間RSD均小于1.0%,相對峰面積RSD均小于3.0%,表明該方法重復性較好。

2.3.5 加樣回收率試驗取已知成分含量的參麥顆粒粉末0.25 g,共9份,按樣品中待測成分含量的50%、100%、150%精密加入各對照品,按“2.1”項下色譜條件分別進樣,計算得到果糖、葡萄糖、蔗糖的平均加樣回收率分別為100.74%、103.20%、101.94%,RSD分別為1.3%、1.4%、2.8%,表明方法準確度良好。

2.4 含量測定取參麥顆粒樣品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,計算樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量,結果見表2。繪制各廠家蔗糖平均含量箱式圖(見圖2)。參麥顆粒處方中規定加入輔料蔗糖的量為920 g,則每袋含蔗糖為23 g,3個廠家蔗糖平均含量均超過23 g/袋,提示制法項未考慮出膏率的變化,固定輔料用量不合理。

表2 參麥顆粒中3個糖類成分的含量測定結果(g/袋)

2.5 參麥顆粒色度值的測定不同廠家生產的參麥顆粒顏色差異明顯,因此通過測定不同批次樣品的色度值準確的分析不同廠家之間的差異性。將參麥顆粒置于同一光源下進行拍照,將照片上傳至Adobe Photoshop軟件測定色度值L*、a*、b*,平行測定5次,取平均值,通過E=(a*2+b*2+L*2)1/2,計算總色度值E[10],結果見表3。

表3 參麥顆粒色度值測定結果

2.6 參麥顆粒糖含量與色度值的分析

2.6.1 相關性分析利用SPSS 21.0軟件對參麥顆粒的色度值(L*、a*、b*)及參麥顆粒中3種糖類(葡萄糖、果糖、蔗糖)的含量進行皮爾遜分析,結果見表4。由表可知,參麥顆粒中果糖和葡萄糖的含量與色度值L*呈極顯著負相關,與a*呈極顯著正相關,與b*呈顯著負相關;表明參麥顆粒的明度越低,顆粒越偏紅、偏藍,對應的果糖和葡萄糖含量越高。3個廠家中,B廠家顆粒的顏色最深,對應的葡萄糖和果糖含量最高,C廠家葡萄糖與果糖含量次之,A廠家最少,有文獻表明,在高溫情況下,蔗糖會分解產生果糖和葡萄糖,并形成一種焦糖色素復雜的混合型化合物,造成顏色的變化[3],提示B廠家制粒過程可能存在溫度過高造成蔗糖分解。

表4 參麥顆粒糖類成分和色澤相關性分析

2.6.2 聚類分析將參麥顆粒的色度值以及3種糖類成分的含量參數導入OriginPro 2021軟件進行系統聚類分析(HCA),結果見圖3。由圖可知,當相對聚類距離為8時,30批樣品按廠家分別聚為三類,聚類效果明顯,表明3個廠家樣品的顏色及所含糖類成分的含量有明顯區別。

圖3 參麥顆粒糖類成分與色度HCA圖

2.6.3 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)以參麥顆粒的色度值(L*、a*、b*)及參麥顆粒中3種糖類(葡萄糖、果糖、蔗糖)的含量為變量,利用SIMCA 14.1軟件進行PLS-DA分析,結果如圖4,模型參數累積方差貢獻率(R2Y)為0.888,預測優度系數(Q2)為0.866,均大于0.5,表明模型構建成功,由圖4可知,3個廠家樣品分別聚為三類,與聚類分析結果一致,其中S26超出邊界范圍,可能是由于其所含蔗糖量比C廠家其他批次樣品中所含蔗糖量少所致。

圖4 參麥顆粒糖類成分與色度PLS-DA圖

2.7 參麥顆粒中糖攝入量評估

2.7.1 糖過量攝入對健康的危害糖作為人體的重要能量來源,貫穿于整個生命歷程。但國內外有研究表明,糖攝入量過多可能會引起口腔健康問題以及糖尿病、肥胖、高血壓、高血脂等一系列代謝性疾病的發生,這些代謝性疾病進而引發心血管疾病[11-12]。牛津大學的Rebecca Kelly等發現從食物中攝取的游離糖越多,相關的心血管疾病風險就越高[13]。James等[14]研究表明控制含糖的碳酸飲料的攝入,可以降低肥胖發生的危險,用助于控制體重,因此控制每日糖的攝入量很有必要[15-16]。

2.7.2 糖攝入相關政策游離糖是指由廠商、廚師或消費者添加到食品和飲料中的單糖(如葡萄糖、果糖)和雙糖(如蔗糖或砂糖)以及天然存在于蜂蜜、糖漿、果汁和濃縮果汁中的糖。WHO建議成年人和兒童應將其每天的游離糖攝入量降至其總能量攝入的10%以下,進一步降低到5%以下或者每天大約25 g會更多益處;《中國居民膳食指南(2022)》中也提出,兒童和成人控制添加糖的攝入量,每天不超過50 g,最好控制在25 g以下。由此可見有關糖攝入量的控制越來越得到全球的關注。

2.7.3 糖攝入量及供能比的計算參麥顆粒是由六味藥材及輔料蔗糖所制的中成藥,參麥顆粒中蔗糖的含量遠遠超過果糖和葡萄糖的含量,因此選擇蔗糖作為評估指標。根據參麥顆粒中蔗糖含量結果,經過簡單評估的方法計算參麥顆粒中蔗糖的每日攝入量(公式1)及其供能比(公式2)。個體攝入的總能量采用“2018年中國居民食物消費量調查”13 083名調查對象的個體食物消費量和《中國食物成分表2002》《中國食物成分表2004》中食物能量數據計算得出。將每日攝入量結果導入OriginPro 2021軟件繪制分組柱形散點圖,結果如圖5所示,由圖可知,蔗糖的日攝入量占總能量攝入的百分比均超過10%,違反了WHO及《中國居民膳食指南(2022)》中的建議,可能會對人體造成危害,因此提醒生產廠家應減少輔料蔗糖的投入或者制備成無糖制劑供患者服用。

圖5 參麥顆粒中蔗糖供能比圖

參麥顆粒中蔗糖的每日攝入量公式為:

參麥顆粒蔗糖日攝入量=F×C

(1)

參麥顆粒中蔗糖的供能比公式為:

(2)

式中,TE(%)為個體供能比,F為每日服藥頻次,C為參麥顆粒中蔗糖含量,TE為個體攝入總能量。

3 討論

實驗考察了供試品溶液的提取溶劑(50%乙醇、70%乙醇、水)、提取時間(10、15、20 min)對果糖、葡萄糖、蔗糖提取效率的影響,通過對比分析發現,用水提取效果更好,并且超聲15 min 3種糖類成分均已提取完全,最終確定供試品制備方法為用水超聲15 min。

采用聚類分析、OPLS-DA分析多種化學計量學分析方法對來自3個廠家的30批參麥顆粒樣品的糖類成分含量與色度值進行了分析,結果表明,3個廠家的平均蔗糖含量均超出了處方規定量,揭示處方規定輔料用量不合理,未考慮出膏率的變化,建議處方更改為“加蔗糖適量,制成1 000 g”。個別廠家顆粒顏色較深,而蔗糖經高溫會發生降解導致顏色加深,提示個別廠家在制粒過程中存在干燥溫度過高的問題,建議廠家注意制粒過程中溫度的控制。3個廠家的30批樣品蔗糖攝入量均超標,建議可研制無糖劑型,增加適用人群。本研究通過測定參麥顆粒色度值及糖類含量,為制備工藝提供參考;通過評估糖攝入量,為指導目標患者合理用藥提供指導。