HS-GC-MS法分析三七炮制品中的揮發(fā)性成分

杜芹芹,楊成

(1.大連理工大學(xué)化工學(xué)院,遼寧 大連 116024;2.大連理工大學(xué)化學(xué)學(xué)院,遼寧 大連 116024)

三七是五加科植物人參三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen]的干燥根及根莖,具有散瘀止血,消腫定痛,調(diào)節(jié)免疫等功效,在治療心腦血管疾病,抗炎抗腫瘤等方面有較好的應(yīng)用[1]。三七的化學(xué)成分包含皂苷類(lèi)、多糖類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)、甾醇類(lèi)、聚炔醇類(lèi)、氨基酸類(lèi)等,其中三七皂苷和三七多糖被認(rèn)為是主要的活性成分,研究最為廣泛[2-4],揮發(fā)性成分的研究相對(duì)較少[5-6]。三七有生品和熟品之分,目前三七炮制有蒸制、油炸、砂燙、微波等,其中蒸制法以其操作方便、溫度易于控制等優(yōu)點(diǎn)而較為常用[7]。三七在臨床應(yīng)用上素有“生消熟補(bǔ)”之說(shuō):生三七偏于活血化瘀、消腫止痛,主要用于降血脂,防止動(dòng)脈粥樣硬化等;熟三七偏于提高免疫、補(bǔ)氣養(yǎng)血,主要用于抗疲勞、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等[8-9]。三七經(jīng)炮制后成分變化明顯,皂苷類(lèi)成分發(fā)生了糖基水解和脫水反應(yīng)[10-11],總黃酮含量降低,多糖含量增加,與三七熟品補(bǔ)血補(bǔ)氣功效增強(qiáng)具有相關(guān)性[12]。但目前為止,尚未有從揮發(fā)性成分角度對(duì)“生消熟補(bǔ)”理論進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道。

頂空進(jìn)樣技術(shù)是一種對(duì)液體或固體樣品中的可揮發(fā)性成分進(jìn)行分析的有效方法,結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于未知揮發(fā)性成分的定性分析,具有簡(jiǎn)便快速,靈敏度高等特點(diǎn),目前在生三七揮發(fā)性成分的研究中已有應(yīng)用[13-15],但鮮見(jiàn)于熟三七的應(yīng)用報(bào)道。本研究采用頂空-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-GC-MS),建立了三七揮發(fā)性成分HS-GC-MS測(cè)定方法,明確了三七及其炮制品的揮發(fā)性成分組成并比較了其變化,對(duì)炮制后成分的變化進(jìn)行了合理地機(jī)理推論,為三七“生消熟補(bǔ)”的藥理解釋提供揮發(fā)性成分的數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司),配電子轟擊(EI)離子源和Combi-PAL多功能進(jìn)樣器(瑞士CTC公司);BS 124 S萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2 材料生三七(Panaxnotoginseng,PN)購(gòu)于大連藥房 (產(chǎn)地為云南文山,批號(hào):20150802,規(guī)格:20頭;批號(hào):20211018,規(guī)格:30頭;批號(hào):20210312,規(guī)格30頭),藥材經(jīng)大連理工大學(xué)李娜副教授鑒定為五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen]的干燥根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備熟三七(SteamedPanaxnotoginseng,S-PN)由同批次生三七經(jīng)過(guò)100 ℃下蒸制3 h,60 ℃真空干燥8 h加工而成[16]。將生、熟三七用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩,備用。

2.2 頂空提取方法精密稱(chēng)取粉碎后的樣品粉末各1.0 g (精確到0.000 1 g),分別放入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中,密封后置于樣品盤(pán)上。樣品瓶加熱溫度為120 ℃,平衡時(shí)間為30 min,進(jìn)樣針溫度設(shè)為100 ℃,進(jìn)樣體積為500 μL。

2.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件氣相色譜條件:DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱 (30 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣為He氣,流速為1.0 mL·min-1,分流比為20∶1。進(jìn)樣口溫度為250 ℃,初始柱溫40 ℃,以10 ℃·min-1的速度升至240 ℃,保持15 min。

質(zhì)譜條件:EI離子源,電子能量70 eV,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度為150 ℃,傳輸線(xiàn)溫度為250 ℃.全掃描采集模式,掃描范圍m/z 30～500,掃描速率1.94 scans·s-1。

2.4 數(shù)據(jù)處理采用NIST 11.L譜庫(kù)進(jìn)行譜圖檢索。根據(jù)匹配度和文獻(xiàn)已報(bào)道物質(zhì)進(jìn)行比對(duì),選擇正匹配度大于800的物質(zhì)。

2.5 頂空條件優(yōu)化平衡溫度和平衡時(shí)間是影響頂空提取效率的兩個(gè)重要因素。本文考察了80、100、120、140 ℃(平衡時(shí)間為30 min)4個(gè)溫度水平對(duì)三七揮發(fā)性成分的影響,結(jié)果如圖1 所示,當(dāng)平衡溫度從80 ℃升到120 ℃時(shí),化合物種類(lèi)隨溫度升高而增加,峰強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。但溫度達(dá)到140 ℃時(shí),幾乎檢測(cè)不到化合物,這是因?yàn)樵?40 ℃時(shí),生、熟三七粉末在頂空瓶中結(jié)塊,影響了揮發(fā)性成分的逸出。此外,本試驗(yàn)對(duì)平衡溫度為120 ℃時(shí)不同平衡時(shí)間(15、30、45 min)下三七揮發(fā)性成分的檢出進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物的種類(lèi)和強(qiáng)度隨著時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)增加,30 min以后趨于穩(wěn)定(結(jié)果見(jiàn)圖2)。最終確定頂空條件為120 ℃下平衡30 min。

a.80 ℃;b.100 ℃;c.120 ℃;d.140 ℃

a.15 min;b.30 min;c.45 min

2.6 揮發(fā)性成分的定性分析生、熟三七在選定條件下的揮發(fā)性成分總離子流圖如圖3所示,從中可以看出它們的差異較大,主要體現(xiàn)在化合物種類(lèi)和相對(duì)含量方面,說(shuō)明炮制對(duì)揮發(fā)性成分有著顯著影響。通過(guò)NIST 11.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索,共鑒定出了126種化合物,采用面積歸一化法測(cè)定各成分的相對(duì)含量,具體如表1所示。

表1 生、熟三七揮發(fā)性成分分析

a.生三七;b.熟三七

生三七中檢測(cè)出103種揮發(fā)性成分,包括14種醛類(lèi)、2種硫化物、3種呋喃衍生物、6種酯類(lèi)、25種醇類(lèi)、8種酮類(lèi)、39種萜烯類(lèi)、4種烷烴和2種雜環(huán)類(lèi)。其中萜烯類(lèi)化合物占總物質(zhì)含量的51.75%,結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。相對(duì)含量超過(guò)2%的化合物有6種,依次為α-古蕓烯(12.58%)、β-蒎烯(8.34%)、甘香烯(5.53%)、β-蓽澄茄油烯(3.80%)、γ-欖香烯(2.30%)、β-依蘭烯(2.00%)。本研究中匹配得到乙醛、丙醛、2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、戊醛、丙酮、2-丁酮、2,3-戊二酮、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、甲醇、乙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇等15種小分子化合物,推測(cè)該部分物質(zhì)可能是三七成分在頂空高溫條件下的裂解或氧化產(chǎn)物。β-欖香烯、β-愈創(chuàng)木烯、γ-杜松烯、β-花柏烯,(+)-瓦倫烯等萜烯異構(gòu)體也在本研究中首次被鑒定出來(lái)。熟三七中檢測(cè)出126種揮發(fā)性成分,包括16種醛類(lèi),3種硫化物,8種呋喃衍生物,7種酯類(lèi),27種醇類(lèi),9種酮類(lèi),9種含氮化合物,1種酸類(lèi),39種萜烯類(lèi),5種烷烴和2種雜環(huán)類(lèi)。由表1和圖4可以看出,三七炮制后揮發(fā)性成分變化主要為醇類(lèi),酮類(lèi)化合物種類(lèi)增多,新生成含氮化合物和乙酸,呋喃衍生物種類(lèi)和相對(duì)含量均明顯增加,萜烯類(lèi)成分略有損失,α-蒎烯、β-蒎烯相對(duì)含量明顯降低。

圖4 生、熟三七揮發(fā)性成分比較

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中嘗試采用頂空瓶中加溶劑后提取三七中揮發(fā)性成分,效果不理想。故試驗(yàn)過(guò)程中是直接對(duì)三七粉末進(jìn)行頂空提取。熟三七經(jīng)過(guò)高溫蒸制和低溫烘干等熱處理后,有部分揮發(fā)性成分相對(duì)含量明顯變化,推測(cè)是因?yàn)樵谂谥七^(guò)程中損失,或者轉(zhuǎn)化為與其結(jié)構(gòu)相似的化合物[17]。生三七中α-蒎烯,β-蒎烯是檢出較多的萜烯類(lèi)成分。研究表明,蒎烯具有較強(qiáng)的抗腫瘤和抗真菌活性,可增強(qiáng)抗生素對(duì)彎曲桿菌的抑制作用,誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生抗驚厥和抗氧化作用,同時(shí)具有鎮(zhèn)痛,抗過(guò)敏以及趨避昆蟲(chóng)等藥物活性[18-20]。這可能與生三七在消腫止痛,活血化瘀方面具有顯著功效相關(guān)。而熟三七中蒎烯相對(duì)含量較低,導(dǎo)致熟三七在消炎方面的藥理活性減弱。熟三七中3-糠醛含量較高 (1.14%),新生成的呋喃類(lèi)衍生物、乙酸、羥基丙酮、1,2-丁二醇以及含氮雜環(huán)化合物等17種物質(zhì)是其特有的成分,推測(cè)均與生三七炮制過(guò)程中發(fā)生美拉德反應(yīng)有關(guān)。生三七中含有多種糖和游離氨基酸[21],具有發(fā)生美拉德反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ),熟三七的熱處理炮制過(guò)程則為美拉德反應(yīng)的發(fā)生提供了必要的外部條件。熟三七中的特有揮發(fā)性物質(zhì),如醛類(lèi),羰基類(lèi),雜環(huán)類(lèi)化合物,大多產(chǎn)生于美拉德反應(yīng)的中間階段,即為烯醇化反應(yīng)產(chǎn)物或Strecker降解產(chǎn)物。研究表明,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有顯著的抗氧化活性,可抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶的活性,降低血壓,保護(hù)心肺功能,可通過(guò)刺激多種免疫細(xì)胞的自然產(chǎn)生來(lái)增強(qiáng)天然免疫和適應(yīng)性免疫[22-23]。熟三七中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的相對(duì)含量較高(7.08%),可能是熟三七發(fā)揮其補(bǔ)益,增強(qiáng)免疫功效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。對(duì)于生熟三七的藥理活性差異與炮制過(guò)程中揮發(fā)性成分的具體相關(guān)性還需要進(jìn)一步的藥理實(shí)驗(yàn)證明,這是后續(xù)將進(jìn)行的工作。

本文通過(guò)頂空-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測(cè)了生、熟三七中的揮發(fā)性成分,共鑒定出126種化合物;對(duì)三七炮制前后的揮發(fā)性成分變化進(jìn)行分析并對(duì)其產(chǎn)生機(jī)理進(jìn)行合理推斷,發(fā)現(xiàn)熟三七中萜烯類(lèi)化合物含量明顯降低,同時(shí)新生成了多種美拉德中間反應(yīng)產(chǎn)物,這有助于多維度評(píng)價(jià)三七炮制工藝。結(jié)合已報(bào)道的化合物的生物活性,從揮發(fā)性成分角度闡釋“生消熟補(bǔ)”的作用機(jī)制,為三七的炮制規(guī)范提供重要的數(shù)據(jù)支持,為三七的深度開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供化學(xué)依據(jù)。但目前三七炮制工藝并未形成規(guī)范,對(duì)不同炮制過(guò)程中揮發(fā)性成分的多維變化也還需要更進(jìn)一步的分析研究。