芍藥苷及芍藥苷磷脂復合物膠束在體腸吸收對比分析

袁騰騰,常紅,唐亞楠,呂淑婕,方亮,王雷,陳衛東*,張彩云*

(1.安徽中醫藥大學藥學院,藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;2.安徽省教育廳現代藥物制劑工程技術研究中心,安徽 合肥 230012;3.中藥復方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012; 4.安徽省道地中藥材品質提升創新協同中心,安徽 合肥 230012)

芍藥苷(PF)是中藥芍藥的主要有效成分,具有廣泛的藥理活性,如抗抑郁、擴張血管、止痛、抗癌、抗炎、降血糖、預防各種腎臟疾病等[1-7]。但PF作為一種高水溶性的酚類化合物,脂溶性差,不易通過細胞膜,生物利用度較低,從而限制了其療效的發揮和臨床廣泛應用[8-10]。將藥物制成磷脂復合物(PLC)可提高藥物的親脂性,促進藥物透過生物膜,改善藥物在胃腸道內的吸收[11]。基于課題組前期制備的芍藥苷磷脂復合物(PF-PLC)及PF-PLC膠束以提高PF的脂溶性和生物利用度的工作基礎[12-13],本研究深入考察了PF-PLC膠束在大鼠體內的腸吸收情況,并與PF進行了比較研究,以期為臨床開發PF-PLC新劑型提供科學實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 試藥芍藥苷(批號:CFN99544,純度:>98%,阿拉丁試劑有限公司);芍藥苷磷脂復合物膠束(實驗室自制);維拉帕米(純度>98%,批號:C13026964);烏拉坦(批號:030412,上海化學試劑廠);甲醇和乙腈均為色譜純,其余試劑均為分析純。

1.2 儀器Ultimate 3000超高效液相色譜儀(Thermofisher公司);循環泵(保定雷弗流體科技有限公司);DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司);高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.3 實驗動物健康SD大鼠,雄性,體重(270±20)g,從安徽醫科大學實驗動物中心處采購。實驗動物生產許可證號:SCXK(皖)2017-001,實驗動物使用許可證號:SYXK(皖)2020-001,倫理號為AHUCM-rats-2021089。從購買之日起,大鼠適應性飼養7 d,環境溫度22～24 ℃,相對濕度50%～65%,12 h/12 h光照/黑暗循環。每天稱量體重,正常飲水飲食,實驗前禁食12 h。

2 方法

2.1 試液的配制Krebs-Ringer(K-R)試液:稱取氯化鈉3.9 g,氯化鈣0.185 g,氯化鉀0.175 g,氯化鎂0.01 g,磷酸二氫鈉0.16 g,葡萄糖1.4 g于1 000 mL燒杯中,加入蒸餾水300 mL,將燒杯放入超聲波清洗器中超聲處理使其溶解完全,再加入0.68 g的碳酸氫鈉粉末,超聲使其溶解完全,再加蒸餾水至500 mL,混勻,即得K-R試液,4 ℃冷藏保存備用。

空白K-R腸灌流液:取K-R液適量,按在體單向腸灌流模型操作方法灌流,收集得空白K-R腸灌流液。

PF儲備液:精密稱取PF 4.01 mg,置于10 mL的棕色容量瓶中,超純水溶解并定容至刻度,得到濃度為 401 μg·mL-1的PF標準儲備液,放置于4 ℃冰箱。

不同濃度PF灌流液:精密稱取PF原料藥,用K-R試液配制成含PF為5、10、20 μg·mL-1的溶液。

不同濃度PF-PLC膠束灌流液:取PF-PLC膠束,用K-R試液配制成的含PF為5、10、20 μg·mL-1的溶液。

2.2 樣品處理方法將收集的待測灌流液樣品吸取一部分于EP管中,5 000 r·min-1,離心5 min后經0.45 μm微孔濾膜過濾后,按上述色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。

2.3 腸灌流樣品分析方法的建立

2.3.1 色譜條件色譜柱:Cosmosil 2.5C18-MS-Ⅱ(3.0 ID×100 mm);流動相:乙腈∶0.1%磷酸(14∶86,V/V);柱溫:30 ℃;流速:0.2 mL·min-1;檢測波長:230 nm;進樣量:2 μL。

2.3.2 專屬性考察在“2.3.1”項下色譜條件,將空白灌腸液,空白灌腸液+PF對照品,含藥灌腸液分別進樣測定,考察其方法專屬性。

2.3.3 標準曲線精密吸取PF對照品儲備液適量置于容量瓶中,用K-R試液將其稀釋,配制成2.5、5、10、20、40、60、100 μg·mL-1PF對照品溶液。按“2.3.1”項下色譜條件,進樣測定,以待測物的峰面積為縱坐標,待測物的濃度為橫坐標進行線性回歸,得標準曲線方程。

2.3.4 精密度試驗精密移取上述PF儲備液,用空白腸灌流液稀釋成2.5、7.5、15.8、75 μg·mL-1的定量下限、低、中、高4個濃度的PF溶液各5份,按照“2.3.1”項下色譜條件進行測定,計算日內精密度和日間精密度。

2.3.5 回收率試驗取7.5、15.8、75 μg·mL-1的低、中、高3個濃度的PF標準品各5份,按照“2.3.1”項下色譜條件進行測定。

2.3.6 穩定性試驗用空白腸灌流液分別配制低、中、高(7.5、15.8、75 μg·mL-1)3個濃度樣品,每個濃度平行配制5份,置于密閉容器中,在37 ℃的水浴中放置,分別于放置3、5、12 h取樣,按照“2.3.1”項下色譜條件進樣,記錄峰面積,計算RSD值。

2.4 大鼠單向腸灌流實驗實驗前用灌流液平衡灌流系統,至進口與出口藥物濃度相等。大鼠實驗前禁食不禁水18 h后,用烏拉坦麻醉后,將四肢固定在手術板上并維持體溫。剪開腹部,分離出小腸,量取十二指腸,兩端切口插管后結扎,結扎總膽管,自幽門處下行2 cm處向下量取約10 cm為十二指腸部位。用37 ℃生理鹽水以1 mL·min-1清洗腸段排出內容物至流出液清澈,用空氣排空腸腔內殘余的生理鹽水,隨后更換含藥灌流液。以0.2 mL·min-1流速灌流并計時,平衡30 min后開始收集流出液,每隔15 min合并1次流出液,收集至150 min結束。處死大鼠,量取每只大鼠十二指腸的長度和半徑,計算灌流腸段表面積。實驗中每只大鼠只使用單一腸段進行單次試驗,以保證大鼠腸道良好的吸收狀態。

本實驗采用質量法計算藥物吸收速率常數(Ka)和有效滲透系數(Peff)。

式中:Cin表示灌流液中入口藥物濃度( μg·mL-1),Cout為出口處實際測得的濃度( μg·mL-1),l為灌流腸段的長度(cm),Q為腸道灌流液的流速(mL·min-1),r表示灌流腸段的內徑(cm)。

3 結果

3.1 專屬性考察專屬性考察的結果見圖1,結果表明,PF及PF-PLC膠束保留時間分別為14.632、14.643 min,空白腸灌流液對PF及PF-PLC膠束的測定沒有干擾,方法專屬性良好。

3.2 標準曲線以峰面積(Y)為縱坐標,濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線并對其進行線性擬合得出線性方程為Y=0.152 1X-0.160 8(R2=0.999 3),結果如表1和圖2所示,表明PF在2.5～100 μg·mL-1的濃度范圍內線性關系良好。

3.3 精密度試驗精密度試驗結果見表2。定量下限、低、中、高濃度的PF溶液日內和日間精密度RSD均小于1.92%,符合HPLC的分析要求。

3.4 回收率試驗回收率試驗結果見表3,表明該方法回收率符合方法學要求。

表3 PF在PF-PLC膠束中的回收率(n=3)

3.5 穩定性試驗穩定性試驗結果如表4所示。結果顯示RSD均小于1.93%,表明PF在該條件下穩定性較好。

表4 PF在不同時間下的穩定性(n=5)

3.6 PF-PLC膠束不同濃度的吸收特性以十二指腸為灌流部位,分別配制含PF 20、10和5 μg·mL-1的PF原料藥和PF-PLC膠束灌流液,按照“2.3.1”項下方法進行操作,分別進行在體腸吸收實驗。結果如表5所示,PF原料藥的腸吸收隨其濃度的增加而有所增加,提示其吸收存在被動轉運途徑,但濃度的增加對腸吸收的影響并不顯著(P>0.05)。由此可以說明PF在脂溶性差的情況下,單純提高藥物的濃度并不能達到有效提高被動轉運的目的。PF-PLC膠束濃度的提高可顯著增加PF的腸吸收(P<0.001,P<0.05),表明PLC膠束的形成可顯著提高PF透過腸道屏障的能力。因此,PF-PLC膠束促進PF腸吸收可能與提高其被動轉運能力有關。

表5 不同濃度PF和PF-PLC膠束的吸收情況

表6 維拉帕米對PF和PF-PLC膠束腸吸收影響

3.7 P-gp抑制劑對PF和PF-PLC膠束吸收的影響考察在十二指腸段中PF和PF-PLC膠束的吸收是否會受到P-gp外排的影響的研究中發現在灌流液中加入維拉帕米后發現,與單純PF組比較,PF的吸收參數(Ka值和Peff值)雖然有增加的趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05);與PF-PLC膠束組比較,加入維拉帕米后差異也無統計學意義,表明維拉帕米的加入對PF和PF-PLC膠束在十二指腸的吸收均無明顯影響。

4 討論

無論是在臨床實踐中還是對于慢性病的長期治療中,口服給藥因具有更好地患者依從性、更低的成本和方便快捷的優點在諸多給藥方式中占據重要地位[14]。藥物經口服給藥后通過胃腸道吸收入血,再經血液循環分布到全身組織器官,從而發揮療效。小腸因其獨特的生理結構,是口服給藥最主要的吸收部位[15]。因此,藥物的腸吸收在一定程度上可以反映藥物經口服后的整體吸收情況。

目前,研究藥物腸吸收的方法主要包括有體內法、在體法和離體法。其中在體單向腸灌流法因其更接近人體生理環境而被廣泛用于吸收行為和機理的研究[16-18]。在本實驗中,在體灌流的速度以0.2 mL·min-1進行單向灌流,低流速可模擬正常生理條件下腸蠕動的速度,對腸壁結構造成的影響小,使實驗結果更加穩定、真實[19]。此外,在灌流的過程中,腸道在吸收藥物的同時,也會吸收或排泄水分,從而導致灌流液的體積發生變化,使得測量結果出現偏差。因此需對灌流液的體積和密度等進行校正。有研究報道,酚紅作為腸灌流實驗的標志物時,會在一定程度上影響藥物的吸收,甚至還可能與藥物發生反應[20-21]。因此,本實驗采用重量法代替經典的酚紅法來測定灌流液的體積變化。以動力學參數Ka和Peff為指標,本研究通過大鼠在體腸灌流模型考察了不同濃度和加入P-gp抑制劑對PF、PF-PLC膠束在十二指腸的腸吸收特性的影響。對比PF和PF-PLC膠束腸吸收結果可見,隨著濃度的增加,PF-PLC膠束在十二指腸的Ka和Peff值較PF均有不同程度的提高(P<0.01,P<0.05)。表明PLC膠束的形成對PF的腸吸收有所改善,且存在被動轉運途徑。這可能與PLC膠束提高被動轉運的能力有關。

P-gp是ATP結合盒(ABC)轉運蛋白的超家族成員之一,是許多藥物的吸收、代謝和排泄的重要決定因素[22-24]。藥物與其親和力的大小反映了生物利用度的高低。維拉帕米作為P-gp抑制劑,可與其他藥物聯合使用,使藥物外排減少,從而提高生物利用度[25]。本實驗在灌流液中加入維拉帕米后發現,與單純PF組比較,雖然有增加的趨勢,但無明顯的差異。同樣,與PF-PLC膠束組比較,差異也無統計學意義,表明維拉帕米的加入對藥物的吸收無顯著影響。以上結果表明,PF-PLC膠束的吸收不受外排轉運體的影響,這可能是生物利用度提高的原因之一。但其他P-gp抑制劑是否會對藥物的吸收產生影響仍需進一步實驗研究。

5 結論

綜上所述,PF-PLC膠束在十二指腸的吸收明顯優于PF。PF-PLC膠束改善腸道吸收的作用不僅是因為促進跨膜轉運能力,而且可能是因為它不會被轉運蛋白作為P-gp的底物分泌回腸腔。依據本研究結果判斷,PF-PLC膠束的主要吸收方式是被動轉運。因此,PF-PLC膠束可以口服來克服PF的生物利用度和吸收差的問題。由此可見,將口服生物利用度差的藥物制成PLC膠束是改善其腸吸收的一種有效途徑,對于提高中藥制劑的口服生物利用度具有重要意義。