基于網絡藥理學和分子對接技術分析少腹逐瘀湯治療盆腔炎的作用機制及功效成分含量測定

陸姍姍,趙玉榮,葛正萍,鄒赟杰,楊曉敏,姚俊宏,陳軍,3

(1.南京中醫藥大學翰林學院,江蘇 泰州 225300;2.南京中醫藥大學,江蘇省中醫外用藥開發與應用工程研究中心,江蘇 南京 210023;3.南京中醫藥大學,江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心,江蘇 南京 210023)

少腹逐瘀湯(Shaofu Zhuyu Decoction,SZD)是清代王清任治療血瘀證的代表藥方之一,記錄于《醫林改錯》中。方中共十味中藥,該方劑以當歸、川芎、赤芍為君藥,調經養血,滋補血氣。輔以臣藥五靈脂、蒲黃、元胡和沒藥,通暢經絡,祛癖止痛進而推陳致新。小茴香、干姜、肉桂為佐藥,溫經散寒除濕,并能引諸藥直達少腹,全方組合使用可溫經驅寒,活血祛疲,消腫止痛,為調理血氣的一大良方[1]。王清任評價此方能“去疾、種子、安胎”,盡善盡美,為真良善方,臨床常用于治療婦科疾病,如原發性痛經、慢性盆腔炎、子宮內膜異位癥等[2-5]。

盆腔炎(pelvic inflammatory disease,PID)是由于逆向真菌感染,通過子宮、輸卵管而進入盆腔,導致女性上生殖道和其周邊組織引起炎癥[6],臨床表現多為下腹疼痛,伴有發熱頭痛、寒顫,下腹包塊和局部有壓迫刺激感。腰酸脹痛,白帶多,月經不調,有淤血,或腹瀉、大小解失調[7]。近年來各醫家發現用SZD治療PID有較好的療效,但目前尚不明確其治療PID的具體作用機制,且其中的功效成分的含量研究較少。因此,本研究借助網絡藥理學和分子對接技術對SZD治療PID的作用機制進行初步的探討,研究功效成分對核心靶點產生作用的信號通路,并對其中的功效成分進行含量測定研究,有望為SZD的質量控制和治療PID的作用機制提供新思路和新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與資料Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司,DAD檢測器);移液槍(Thermo Scientific);TGL-168高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);ME104E萬分之一分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];LXJ-B低速大容量多管離心機(上海安亭飛鴿儀器有限公司);KH-500B超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司);RE-52旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);HH-ZK1恒溫水浴鍋(南京科爾儀器設備有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循環真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司);EAC-10T(南京易普易達科技發展有限公司)。

中藥系統藥理數據庫和分析庫(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、SwissADME(http://www.swissadme.ch/)、有機小分子生物活性數據庫(PubChem,https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)、UniPort(https://www.uniprot.org/)、OMIM(https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、BioinfoGP(https://bioinfogp.cnb.csic.es/)、STRING(https://www.string-db.org/)、Metascape(https://metascape.org/gp/#/main/step1)、微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)、蛋白質結構數據庫(RCSB,https://www1.rcsb.org/)、Cytoscape 3.8.3、OpenBable2.4.1、AutoDockTools 1.5.7。

1.2 試劑與材料川芎、延胡索、赤芍、干姜、小茴香、蒲黃(批號分別為210719、210310、200715、180115、180809、191210)均購自南通三越中藥飲片有限公司;當歸、五靈脂(批號分別為210601、200701)均購自江蘇承開中藥有限公司;沒藥、肉桂(批號分別為210330、210709)購自安徽康和中藥科技有限公司。沒食子酸(批號:K1714020,含量≥98%)購置于阿拉丁試劑(上海)有限公司;阿魏酸(批號:H27J7L16718,含量≥98%)、芍藥內酯苷(批號:O31GB166251,含量≥91.4%)、咖啡酸(批號:M27GS143417,含量≥98%)、異鼠李素-3-O-新橙皮苷(批號:Y17N9H75485,含量≥98%)、延胡索乙素(批號:6024-85-7,含量≥98%)、四氫非洲防己堿(批號:483-34-1,含量≥95%)均購置于上海源葉生物科技有限公司;甲醇(色譜級,批號:67-56-1)、乙腈(色譜級,批號:75-05-8)均購自南京晚晴化玻儀器有限公司;其余試劑為分析純。

1.3 網絡藥理學分析

1.3.1 SZD目標成分和疾病作用靶點相關數據集的建立通過中藥系統藥理數據庫和分析庫(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),以口服生物利用度值(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性值(drug-likeness,DL)≥0.18為條件對SZD中的中藥的化學成分進行篩選,同時結合文獻的檢索[8],獲取有效成分。其中,因“五靈脂”并未在TCMSP中有記錄,所以查詢相關文獻[9],BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)中檢索其有效成分,并在SwissADME(http://www.swissadme.ch/)中對檢索到的有效成分進行篩選,其條件為,Pharmacokinetics中的GI absorption為“High”,Druglikeness中前5項至少有2項為“Yes”[10]。

1.3.2 藥物成分和疾病靶點的預測與篩選以各有效成分的英文名為關鍵詞在有機小分子生物活性數據庫(PubChem,https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)進行檢索,選擇綜合性最高的,下載其3D結構。利用PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)對成分的作用靶點進行預測。根據文獻[11],以“Norm Fit>0.8”對在PharmMapper中預測所得的靶點進行篩選。將靶點導入UniPort(https://www.uniprot.org/),限定物種為“Human”,并將靶點名稱轉換為相應的Gene Id。通過OMIM(https://omim.org/),Gene Cards(https://www.genecards.org/),DrugBank(https://go.drugbank.com/)等數據庫挖掘PID靶點,以“PID”為關鍵詞進行檢索,將名字并未轉換為Gene Id的靶點導入UniPort蛋白數據庫(https://www.uniprot.org/),并限定物種為“Human”進行轉換。合并在3個數據庫收集轉換過的靶點,刪除重復值,得到PID的靶點。

1.3.3 收集SZD-PID共同靶點并構建蛋白質互作網絡將SZD的靶點與PID的靶點導入BioinfoGP(https://bioinfogp.cnb.csic.es/),繪制Veen圖獲得交集靶點,將交集靶點導入STRING(https://www.string-db.org/),將群體設置為“Homo Sapiens”,可獲得交集靶點的初步PPI網絡圖,設置“minimum required interaction score”為“Highest Confidence”刪除游離的靶點,接著將網絡圖導出為tsv格式,導入Cytoscape 3.8.3對其進行分析,最終得到SZD-PID的關鍵靶點。將中藥、各中藥的藥物成分和藥物成分的關鍵靶點導入Cytoscape 3.8.3軟件中,構建中藥-有效成分-靶點網絡圖。

1.3.4 GO功能和KEGG通路富集分析基因功能注釋分析數據庫Metascape(https://metascape.org/gp/#/main/step1)集成了諸多權威生物信息數據庫。因此,先將交集靶點導入Metascape,設H.Sapiens為生物群體,再分次進行KEGG通路富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和GO Molecular Functions;GO Biological Processes ;GO Cellular Components 功能富集分析,即得到信號通路,分子功能,生物過程,細胞組成的相關的富集分析結果。以KEGG通路結果的繪圖分析為例,將得到的KEGG通路將log P值轉換為P值后,按P值從小到大進行排序,排列出前20的信號通路,利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)對20條通路進行可視化分析,進行富集氣泡圖的繪制。

1.3.5 分子對接技術驗證功效成分與核心靶點結合的能力分子對接是通過結構特征來預測成分與目標蛋白結合能力的一種輔助手段,涉及分子間的空間匹配和能量匹配[12]。選取有效成分排名靠前的幾種成分,在PubChem下載藥物小分子配體并保存為sdf格式,接著通過OpenBable 2.4.1轉換為mol2格式。然后在蛋白質結構數據庫RCSB(https://www1.rcsb.org/),按照Resolution大小排序,下載Resolution最小值的大分子蛋白并保存為PDF格式。接著將PDF格式的蛋白導入pymol進行去水去配體的操作,將操作好的文件導入AutoDock Tools 1.5.7進行兩次對接,對接結果保存為PDBQT格式,將PDBQT格式的文件另存為PDB格式,將PDB格式的對接結果導入pymol進行分析對接結果可視化分析。

1.4 含量測定方法的建立

1.4.1 色譜條件以Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱;以乙腈為流動相A,0.1%甲酸水溶液為流動相B,按如下設置進行梯度洗脫:0～3 min,1% A→5% A;3～5 min,5% A→10% A;5～10 min,10% A→30% A;10～20 min,30% A→33% A;20～22 min,33% A→5% A;柱溫35 ℃;流速1.0 mL·min-1;進樣量10 μL;檢測波長為260 nm(測定阿魏酸時為323 nm)。

1.4.2 對照品溶液的制備精密稱取阿魏酸、芍藥內酯苷、沒食子酸、咖啡酸、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、延胡索乙素、四氫非洲防己堿對照品適量,各自加甲醇溶解,定容于10 mL棕色容量瓶中,作為對照品溶液。分別取對照品溶液各1 mL,混勻后過0.45 μm微孔濾膜,即得混合對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液的制備按藥典比例(當歸-川芎-赤芍-肉桂-小茴香-五靈脂-沒藥-蒲黃-延胡索-干姜3∶2∶2∶1∶0.2∶2∶2∶3∶1∶0.2)稱取各藥材共164 g,置圓底燒瓶中,用10倍量水煎煮提取2次,每次40 min,合并煎出液,用旋轉蒸發儀減壓濃縮至稠膏狀,冷凍干燥得SZD凍干粉末[8]。取凍干粉末1 g,加甲醇10 mL,稱重,超聲(250 W,40 kHz)處理30 min后,再稱重,用甲醇補重,經3 000 r·min-1離心10 min,取上清液過0.45 μm微孔濾膜,待進樣分析。

1.4.4 含量測定方法的建立及方法學考察

1.4.4.1 線性關系考察精密量取混合對照品溶液,分別稀釋一定倍數后,按設定的色譜條件進樣檢測,以質量濃度為橫坐標(X),對照品峰高為縱坐標(Y),繪制標準曲線,計算回歸方程。

1.4.4.2 精密度試驗精密稱取樣品,進行供試品溶液的制備并連續進樣6次,計算供試品溶液中的阿魏酸、芍藥內酯苷、沒食子酸、咖啡酸、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、延胡索乙素、四氫非洲防己堿的峰高RSD。

1.4.4.3 重復性試驗精密稱取樣品6份,進行供試品溶液的制備并進行測定,計算供試品溶液中的7種藥物的質量分數RSD。

1.4.4.4 穩定性試驗精密稱取樣品,進行供試品溶液的制備,分別在0、2、4、8、12、24 h進行測定,計算供試品溶液中7種藥物的保留時間及峰面積的RSD結果。

1.4.4.5 加樣回收率試驗取已知含量的同一批供試品,精密稱定6份,分別按已知指標成分含量的100%加入7種藥物的混合對照品溶液,制備供試品溶液并進行測定,計算以上各成分平均加樣回收率。

2 結果與分析

2.1 SZD有效成分的收集及其靶點的預測與篩選通過中藥系統藥理數據庫和分析庫,以OB≥30%、DL≥0.18作為條件對SZD的化學成分進行篩選,共檢索出160個有效成分。其中,五靈脂在TCMSP中并未有收錄,在查詢文獻和BATMAN-TCM數據庫,經過在SwissADME整合后得到58個有效成分。因此,SZD組方中共篩選出218個有效成分。

通過Pharmmapper平臺進行預測,以“Norm Fit>0.8”為條件對得到的靶點進行篩選,剔除重復靶點后共獲得了199個靶點。通過OMIM、GeneCards、DrugBank挖掘PID的靶點,經合并去重,共整合得到2558個靶點。

2.2 SZD-PID共同靶點的收集將在數據庫挖掘的相關治療PID的靶點與SZD的功效成分的作用靶點在BioinfoGP相互取交集,共篩選出97個交集靶點,繪制Veen圖(見圖1),即為SZD治療PID的潛在靶點。

圖1 SZD-PID靶點交集圖

2.3 靶點的蛋白質互作網絡構建將SZD與PID的交集靶點輸入STRING數據庫,即可獲得PPI網絡。在Cytoscape中導入蛋白網絡的tsv文件進行分析,如圖2所示。有顏色的節點表示為靶點,而直線代表各節點間相互作用關系,共包括70個節點,352條線。節點的大小,節點內文字的大小,顏色的深淺都與節點的degree值呈比例關系,degree值越大,顏色越深,節點越大。首先利用degree值的二倍中位值進行第一遍篩選,接著利用CytoNCA插件進行拓撲分析篩選后節點的BC(betweenness centrality)、CC(closeness centrality)、degree的中位值進行第二遍篩選,其中degree的中位值為18,BC為0.053 535,CC為0.589 744,其中以上3 個參數都大于中位值的靶點有14個,以degree值為最終標準,選取蛋白酪氨酸激酶類(SRC)、熱休克蛋白類(HSP90AA1)、絲裂原活化蛋白激酶類(MAPK1)3個靶點蛋白作為核心靶點進行進一步的研究,其相關信息見表1。

表1 靶點信息

圖2 PPI網絡互作圖

2.4 GO富集和KEGG通路分析為了進一步了解SZD治療PID的具體作用機制,在Metascape內導入交集靶點進行KEGG和GO富集分析。獲得KEGG通路160條,BP為1 059條,CC為54條,MF為94條。由圖3可知,KEGG中排名前幾條,涉及基因數較多,排名前幾的通路分別為癌癥中的通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、FOXO信號通路、內分泌抵抗等。

圖3 KEGG通路和BP富集分析圖

圖4 CC和MF富集分析圖

GO功能富集分析是指在某一功能層次上統計所涉及的蛋白或基因數目而組成的有向無環圖,包括分子功能,生物過程,細胞組成[13]。經篩選,由GO富集分析結果圖3～4可知,SZD治療PID的作用靶點中排名較為靠前的生物過程主要是對激素的響應、激酶活性的調節、酶聯受體蛋白信號通路、激酶活性的正向調節等。涉及的細胞組成為囊腔、分泌顆粒腔、細胞質泡腔、膜筏等。涉及的分子功能為蛋白激酶活性、激酶活性、脂質結合等。

2.5 中藥-有效成分-靶點網絡圖的構建中藥復方通常具有多種藥理作用,其成分可能作用于多個不同的靶標[14]本研究構建的中藥-有效成分-靶點網絡圖(見圖5)包含個325節點,3 420條邊,但僅顯示114種成分,這是因為另外多種成分在數據庫中未有相關靶標的記錄。不同顏色和形狀的節點分別代表了SZD的中藥組成,有效成分和潛在靶點。黃色為SZD中的十味中藥,粉色菱形節點為潛在靶點,多色圓形為不同中藥的有效成分。對節點網絡進行分析以篩選網絡中關鍵的成分,其中,排名前幾的成分包括阿魏酸、芍藥內酯苷、沒食子酸、咖啡酸、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、延胡索乙素、四氫非洲防己堿,表明這7種成分可能是SZD治療PID的關鍵成分。

圖5 “中藥-有效成分-潛在治療靶點”網絡

2.6 分子對接實驗驗證功效成分與核心靶點的結合能力分子對接技術是基于模擬配體與受體作用(包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華作用等),預測蛋白-蛋白或小分子-蛋白間的結合模式及親和力,從而虛擬篩選藥物靶點及預測藥效成分。由 PPI 的結果可知基因SRC、MAPK1、HSP90AA1在SZD治療PID的生物網絡中扮演著重要角色,故利用Autodock對上述核心靶點與篩選出的7種成分進行分子對接,從而檢驗化合物和靶點的結合活性。由統計的對接結合能可知(結果見表2,可視化分析見圖6),多項分子對接平均結合能均小于0,表明核心靶點與關鍵成分之間能夠自發地進行有效地結合。其中,異鼠李素-3-O-新橙皮苷與SRC和MAKP1靶點的平均結合能為0.06,不能自發地結合,延胡索乙素和MAKP1之間無氫鍵的作用,無法給出分子對接的可視化圖。因此,SZD可能通過以上關鍵靶點干預PID的相關通路,從而達到改善或者治療PID的作用。

表2 SZD的功效成分與靶點的分子對接結合能

2.7 SZD中治療PID的功效成分的含量測定

2.7.1 方法學考察SZD中7種功效成分的線性關系結果如表3和圖7所示,在一定濃度范圍,7種成分的線性關系良好。穩定性的結果表明儀器精密度良好、試驗方法的重復性和穩定性良好,加樣回收率結果表明試驗方法的準確率高。

表3 7種成分含量測定的方法學考察結果

2.沒食子酸;6.咖啡酸;8.芍藥內酯苷;11.阿魏酸;12.異鼠李素-3-O-新橙皮苷;13.四氫非洲防己堿;16.延胡索乙素

2.7.2 樣品的測定取3批SZD飲片,制備供試品溶液進行峰面積的測定,計算7種功效成分的含量并計算均值,其中,阿魏酸、芍藥內酯苷、沒食子酸、咖啡酸、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、延胡索乙素、四氫非洲防己堿7種功效成分的含量分別為(1.273±0.038)、(0.533±0.057)、(0.093±0.012)、(0.122±0.016)、(4.009±0.140)、(1.069±0.130)、(0.296±0.022) mg·g-1。

3 討論

本文研究發現SZD治療PID的主要靶點有SRC[15-16],MAPK1[17-19],HSP90AA1[20-21]等,主要涉及的生物過程有激素的反應、激酶活性的調節等,細胞組分為囊腔、分泌顆粒腔、細胞質泡腔等,分子功能有等蛋白激酶活性、以醇類作為受體的磷酸轉移酶活性等。主要的信號通路主要參與調節癌癥的途徑、MAPK信號通路[22-24]、PI3K-Akt信號通路[25-29]等通路發揮調控作用。利用拓撲分析對網絡模型進行分析,發現SZD的多成分多靶點的藥理作用形成了復雜的網絡,篩選出關鍵的7種功效成分。通過分子對接驗證[30-32],發現7種功效成分與核心靶點有較好的結合活性。因而本研究認為,SZD治療PID的作用機制[33-34],是通過關鍵功效成分與核心靶點相結合,調控相關的信號通路,抑制炎癥因子的活性,降低炎性反應,從而發揮治療PID的作用[35-36]。并通過HPLC-DAD法進行SZD中7種成分的含量測定研究,揭示出湯中治療PID的有效成分的含量,為SZD的臨床應用提供有力支撐。