液質聯用法測定魚肉中安眠酮的不確定度評定

◎ 佟芳荻，張 煒，謝安娜，林惠鎮

（深圳市中鼎檢測技術有限公司，廣東 深圳 518000）

測量不確定度的定義是根據所得到的信息，表征賦予被測量量值分散性的非負參數[1]。測量結果的不確定度分為A類不確定度和B類不確定度。A類不確定度指的是用對觀測列統計分析的方法來獲得的不確定度；B類不確定度指的是用不同于對觀測列統計分析的方法來獲得的不確定度[2]。目前，安眠酮殘留量的檢測方法主要有液質聯用法[3]和氣相色譜法[4]。本研究建立了LCMS/MS法測定魚肉中安眠酮殘留量測不確定度的評定方法，依據檢測法建立安眠酮殘留量的數學模型，通過對不確定度分量的量化結果計算出各個分量的標準不確定度，合成后得到測量結果相對標準不確定度。分析不同分量對不確定度的影響，為完善該方法檢測魚肉中安眠酮殘留量的質量控制體系提供理論基礎。

1 實驗步驟

1.1 試劑及設備

液質聯用儀：配有ESI源；天平：最小分度量為0.1 mg；移液器：100～1000μL；容量瓶：10 mL，25 mL。純水：GB/T 6682規定的一級水；甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；丙酮：色譜純；甲酸：色譜純；乙醚：色譜純。安眠酮（CAS號：75-44-6）；安眠酮-D7（CAS號：136567-41-8）。

1.2 測試步驟

稱取已均質的魚肉5 g，置于50 mL離心管中，加入內標，加水3 mL，渦旋混勻，加15 mL正己烷，振蕩超聲提取，離心后取上清液至25 mL容量瓶中，殘渣用8 mL正己烷重復提取1次，合并上清液，用正己烷定容至刻度，備用。取10 mL備用液，經硅膠固相萃取小柱凈化，洗脫液40 ℃氮吹至近干，用1 mL定容液定容，過0.22 μm濾膜，用液質聯用儀檢測[5]。

2 建立數學模型

式中：W為樣品含量(μg/kg) ；C0為樣品溶液中安眠酮的濃度(ng/mL)；V為樣品溶液的體積 (mL)；m為樣品的質量(g)；R為回收率；f為稀釋倍數；P為代表重復性的校正因子。

3 不確定度分量的主要來源及其分析

采用GB 31656.5—2021測定水產品中安眠酮殘留量的不確定度來源如圖1所示。

圖1 安眠酮殘留量的不確度來源圖

4 不確定度分量的量化

4.1 測量結果重復性帶來的不確定度

在一定時間內對樣品溶液的濃度測定P=6 次，結果見表1。

表1 安眠酮殘留量的測定結果表（P=6）

4.2 定量曲線擬合帶入的不確定度評定

此次評定采用n=6個不同濃度水平的每一點重復測試m=3次（表2），標準曲線公式：y= 0.256715x-0.03991，式中：y為外標峰面積與內標峰面積的比值；x為標液濃度ng/mL；線性相關系數r2= 0.99995；斜率k=0.256715；截距b=0.039910。

表2 標準曲線擬合表

4.3 標準溶液配制引入的不確定度

標準溶液配制過程如下。

用量程為200 μL的移液器移取100 μg/mL的安眠酮標準溶液100 μL于50 mL容量瓶中。用量程為200 μL的移液器移取10 μg/mL的安眠酮-D7標準溶液100 μL于25 mL容量瓶中。

加甲醇定容至刻度，此為濃度200 ng/mL的安眠酮標準工作液；濃度40 ng/mL的安眠酮-D7標準工作液。查詢標準物質證書得知，安眠酮純度99.9%，u(STD)= 5%(k=2)，其相對標準不確定度為：

用200 μL移液器吸取100 μL安眠酮標準溶液，允許誤差為±2.0%，假設為均勻分布，其標準不確定度為：

定容所用50 mL容量瓶為檢定A級，允許誤差為±0.05 mL，假設為三角分布，其標準不確定度為：

實驗室溫度在20±5 ℃內波動，甲醇的膨脹系數為1.19×10-3mL/℃，假設為矩形分布，其標準不確定度為:

綜上可知，由安眠酮標準工作液配制引入的相對標準不確定度為：

查詢標準物質證書得知，安眠酮-D7純度99.1%，u(STD)= 5% (k=2)，其相對標準不確定度為：

用200 μL移液器吸取100 μL安眠酮標準溶液，允許誤差為±2.0%，假設為均勻分布，其標準不確定度為：

定容所用25 mL容量瓶為檢定A級，允許誤差為±0.03 mL，假設為三角分布，其標準不確定度為：

實驗室溫度在20±5 ℃內波動，甲醇的膨脹系數為1.19×10-3mL/℃，假設為矩形分布，其標準不確定度為：

綜上可知，由安眠酮-D7工作液配制引入的相對標準不確定度為：

4.4 樣品稱量引入的不確定度

用最小分度為0.001 g的天平稱取5 g樣品，天平的允許誤差為±0.005 g，假設為矩形分布，其相對標準不確定度為：

4.5 加標回收率引入的不確定度

本次實驗進行6次獨立的回收率測試，求得不確定度，結果如表3。

表3 安眠酮殘留量的回收率表（n=6）

同時進行顯著性檢驗，以確定回收率校正因子是否在計算公式中采用。

用顯著性檢驗來確定平均回收率是否與1.0有顯著性差異。檢測統計數據t：

這個數值與n-1自由度，置信度為95%的雙邊臨界值tcrit比較：t＜tcrit=4.3，則回收率與1無顯著性差異。因此，校正因子（1/R）不需要在結果的公式計算中采用。

5 計算合成相對標準不確定度及擴展不確定度

如表4所示為不確定度分量結果表。

表4 不確定度分量結果表

5.1 計算合成相對標準不確定度

5.2 計算擴展不確定度

由實驗數據計算得出樣品中安眠酮的含量為0.497 μg/kg，測量結果的合成標準不確定度為0.497×0.05239=0.02603 μg/kg，取包含因子k=2，以正態分布估計，則置信概率約為95%，計算的擴展不確定度為u=0.02603×2=0.0521 μg/kg。

6 結論

LC-MS/MS方法檢測魚肉中安眠酮殘留量的測量結果可表示為：(0.497±0.053)μg/kg，k=2。其中對不確定度貢獻較大的分量為樣品測量重復性產生的不確定度，標準工作液配制過程中產生的不確定度，標準曲線擬合的不確定度。

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