間充質干細胞在正畸牙移動及牙根吸收中的研究進展

楊春先，張丹，唐丁炫 綜述 張疆弢 審校

遵義醫科大學附屬口腔醫院正畸科一組，貴州 遵義 563000

錯 畸形是指牙齒、頜骨、顱面的畸形，嚴重影響人們的口腔健康及顏面部的美觀，需進行正畸治療。正畸牙移動(orthodontic tooth movement，OTM)是正畸治療的基礎，依賴于牙周膜和牙槽骨的協調性改建。正畸牙根吸收(orthodontic root resorption，ORR)是正畸治療的常見并發癥[1-2]，部分吸收的牙根在正畸力去除后會修復，但能力有限，而且有部分牙根無法修復[3]。正畸療程長，隨著年齡增加，患者出現牙根吸收、牙移動緩慢等情況的風險增加，如何加快牙移動、減少和修復牙根吸收是正畸領域研究的熱點。

多種手術及非手術方法已用于加速牙移動，多種藥物及物理方法用于減少或修復牙根吸收，但效果都存在不確定性，于是學者們轉向了干細胞療法。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類增殖能力強、有多系細胞分化潛能及免疫調節功能的細胞。MSCs不僅分化為成骨細胞直接參與骨形成和骨再生[4]，還通過影響破骨細胞生成來參與骨吸收[5]。OTM 的骨改建包括移動牙的張力側成骨和壓力側發生骨吸收，MSCs 對成骨細胞和破骨細胞的影響是MSCs 參與OTM 骨改建的關鍵，MSCs 可通過加速骨改建而加速牙移動。MSCs 有向牙周膜細胞、成牙骨質細胞等牙周組織細胞分化的潛能和免疫調節功能，可再生牙周膜、牙骨質等組織[6-7]，這些特性使MSCs對牙根吸收產生抑制和修復作用。通過綜述不同來源MSCs 對正畸牙移動和牙根吸收的影響及可能的機制，可為干細胞應用于加速牙移動和防治牙根吸收的研究提供參考。

1 MSCs對正畸牙移動的影響

1.1 OTM的生物學基礎 OTM依賴于多種細胞及生物因子作用下牙周組織的協調性改建。正畸力從牙齒傳遞至牙周組織，牙周組織局部缺血缺氧和液體流動而引發無菌性炎癥級聯反應，牙周膜和牙槽骨發生改建，牙齒發生移動，多種細胞如MSCs、成骨細胞、破骨細胞和多種炎癥因子如環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(ⅠL-1β)以及組織改建因子如巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、核因子κB 受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)、核因子κB 受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、轉化生長因子-β(transforming growth factorβT，GF-β)參與其中[8]。牙槽骨改建由移動牙張力側成骨細胞成骨和壓力側破骨細胞吸收骨來完成。TGF-β介導牙周組織中的MSCs 增殖分化為成骨細胞[9]。破骨細胞的分化主要由M-CSF和RANKL調節，成熟的關鍵途徑是RANKL/RANKL/OPG 信號通路的激活，破骨細胞被激活后進行骨吸收[10]，OTM 的速率主要取決于破骨細胞活性和骨吸收過程[11]。牙周膜是一層對機械敏感的纖維結締組織，可將正畸力從牙齒傳遞到牙槽骨并為骨改建提供穩定的微環境[12]，去除正畸力后，牙周膜在新的位置上通過改建重新恢復正常結構、形態、功能及與牙槽骨、牙骨質的連接。

1.2 不同來源MSCs對OTM的影響

1.2.1 牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs) 內源性PDLSCs 參與OTM 中的成骨和破骨并促進骨改建、加速牙移動。PDLSCs 在2004年首次從PDL 中分離出來并被鑒定為MSCs，具有克隆增殖、多向分化和免疫調節特性[13]。MSCs 在維持骨穩態中起重要作用，成骨細胞和破骨細胞活性之間的平衡是OTM 骨改建的關鍵，PDLSCs是牙周膜特異性MSCs，OTM 中的骨改建是通過PDLSCs 實現的[14-15]。PDLSCs 對機械負荷敏感，在張力和壓力刺激下，PDLSCs 可向成骨細胞分化和調節破骨細胞的形成[16-17]。OTM 中，PDLSCs 通過產生高水平的炎性細胞因子和趨化因子來響應正畸機械力[18-19]并影響破骨細胞和成骨細胞的增殖分化及功能來參與骨改建[20]。黃華明等[16]認為PDLSCs的增殖分化潛能可用于重建牙周組織，從而加速正畸治療。近來的研究證實了PDLSCs 通過分化為成骨細胞和促進破骨細胞生成、增強其活性來加快骨形成和骨吸收，進而加速牙移動。牙周膜中的Gli1+細胞已被證實是PDLSCs[21]，使用抑制劑或遺傳消融來減少或清除Gli1+細胞會抑制張力側成骨和減少壓力側破骨細胞數量而抑制骨改建、減慢牙移動[22]。巨噬細胞包括M1 和M2 樣巨噬細胞，其中的M1 樣巨噬細胞可產生ⅠL-1β、TNF-α等促炎因子，這些因子促進OTM 中的骨吸收和牙根吸收[18，23]。MSCs在骨改建中調節巨噬細胞極化，硫化氫(H2S)是一種由MSCs 產生并與骨穩態有關的氣體遞質。機械負荷下PDLSCs 產生更多的H2S 來激活M1樣巨噬細胞極化及增加破骨細胞的數量和活性，進而促進骨改建及牙移動[24]。單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和RANKL促進OTM 中巨噬細胞的遷移和破骨細胞的分化，PDLSCs 在正畸力誘導下產生的內源性H2S 通過促進MCP-1 的分泌和RANKL 的表達而促進OTM 中的破骨活動[19]。研究還表明PDLSCs在去除正畸力后通過TGF-β信號介導壓力側牙周膜的恢復，進而促進牙移動復發[25]。因此，如何精準調控PDLSCs 的功能可能是未來研究加速牙移動、減少牙移動復發的重點。

1.2.2 脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs) 移植外源性ADSCs可增加上頜擴弓時牙齒頰側移動的距離。上頜橫向擴弓是常見的正畸治療措施，通常是打開腭中縫來擴寬牙弓，但難以避免上頜后牙頰側移動，后牙過度頰側移動會出現牙槽骨高度降低、牙根吸收等并發癥[26]。Gul 等[27]發現移植ADSCs 到大鼠牙周組織后增加了大鼠磨牙在擴弓期向頰側移動的距離，且與對照組相比，移植細胞組牙周組織中炎癥因子COX-2 和與破骨細胞分化成熟相關的RANKL 減少、OPG 含量增加及OPG/RANKL 比值增大。PDLSCs 在OTM 過程中調節成骨細胞和破骨細胞的增殖和分化，對牙周和骨的重塑有重要作用。外源性MSCs 可通過旁分泌機制激活駐留的祖細胞而發揮作用[28]，ADSCs 具有成骨分化和向PDL分化的高潛能[29-30]。Feng 等[25]、Safari 等[31]認為他們移植的ADSCs 可能通過自身分化作用或間接激活牙周組織中駐留的PDLCSs 來影響成骨細胞-破骨細胞的轉換及加速骨重建，加快清除牙周膜透明樣變區域及促進牙周膜改建，進而阻止或縮短牙移動延遲期、從而促進OTM。

1.2.3 骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs) 移植的BMMSCs 促進破骨細胞形成及增強其活性加速骨改建，進而加速牙移動。RANKL 與RANK 結合誘導破骨細胞分化，Wang 等[10]發現在M-CSF 刺激下，受壓的小鼠骨髓間充質干細胞(mice bone marrow mesenchymal stem cells，mBMMSCs)中RANKL 的表達明顯高于未受壓的mBMMSCs。正畸加力10 d 后，尾靜脈注射移植mBMMSCs 的小鼠較注射生理鹽水的對照組小鼠牙移動距離顯著增加且壓力側破骨細胞增多、破骨活動增強。李一涵等[32]的研究證實移植骨髓間充質干細胞與顆粒型多孔β磷酸三鈣(beta-tricalcium phosphate，β-TCP)支架能良好地修復牙槽骨缺損區，并且缺損區鄰牙在此修復區內早期移動時，該區域再生的牙周組織改建活躍、有加速牙移動的趨勢。Kanzaki 等[33]和Dunn等[34]發現PDL中OPG水平的升高會減少牙槽骨吸收而減慢牙移動速率，但OPG作用的效果具有劑量依賴性。Gul Amuk 等[27]在正畸加力期間向大鼠移植BMMSCs后發現其牙周膜OPG增高，認為他們移植的BMMSCs可能也會以同樣的方式減慢牙移動，但其研究中缺乏數據來證明這一猜測。綜上所述，MSCs 是牙移動骨改建的關鍵細胞，其成骨分化潛能直接影響骨形成，張力刺激下MSCs 成骨分化增強、促進骨形成；壓力刺激下MSCs調節破骨細胞形成及其活性，促進破骨，加速骨改建及牙移動。

2 MSCs對正畸牙根吸收的影響

2.1 正畸牙根吸收的生物學基礎 正畸牙根吸收是正畸負荷引發無菌性炎癥引起牙根表層牙骨質的吸收，更嚴重的會涉及牙本質的吸收[1]。破牙細胞負責牙根的吸收，包括破牙骨質細胞和破牙本質細胞，由其前體細胞在趨化作用下從牙周膜中游走并轉化而來。破牙細胞在黏附素、整合素和細胞外基質蛋白作用下黏附于牙根表面，在多種酶如抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)、組織蛋白酶和基質金屬蛋白酶作用下吸收牙根表面的礦物質和降解有機物[1，35]。RANKL/RANK/OPG 信號通路通過影響破牙細胞的活性參與牙根吸收的調控[1，36]，炎癥因子如前列腺素、白介素1、COX-2 和TNF-α通過促進炎癥的產生而促進牙根吸收[35，37-38]。吸收的牙根由牙周膜前體細胞/干細胞分化為成牙骨質細胞并形成牙骨質來修復[20，39]，同時牙周膜中產生新生Sharpey 纖維附著于這些牙骨質中形成牙周膜和牙根表面的連接，進而恢復牙根的形態和功能[40]。牙根吸收區的某些非細胞物質也參與牙根的修復，纖維連接蛋白、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)等細胞外基質蛋白有助于招募成牙骨質細胞前體細胞至牙根表面并促進其黏附增殖和分化為成牙骨質細胞；局部的細胞因子和生長因子如骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)和TGF-β等在成牙骨質細胞細胞前體細胞分化和成牙骨質細胞增殖中發揮重要作用[41]。

2.2 不同來源的MSCs 對正畸牙根吸收的影響 MSCs 通過向不同種類的細胞分化及免疫調節功能來修復或替代缺損的組織，現已被廣泛用于口腔組織的修復和再生，不同種類MSCs 如PDLSCs、BMMSCs、ADSCs 等在體內均可誘導牙周組織再生[42]。移植部位的微環境可提供干細胞分化所需的營養物質、生長因子和細胞外基質，是干細胞分化為不同類型細胞的關鍵[43]。MSCs 在牙本質塊上體外培養時表達成牙骨質細胞分化及牙體硬組織礦化相關的OPN 和骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)，移植到牙周組織微環境中的MSCs可分化為成牙骨質細胞和成纖維細胞并形成牙骨質和牙周膜[44]。正畸牙根吸收與無菌性炎癥相關，多種炎癥因子促進牙根吸收，吸收的牙根恢復其形態和功能需要形成新的牙骨質和重建正常形態的牙周膜。MSCs的免疫調節功能及生成牙骨質/PDL 樣復合物的潛力使其應用于正畸牙根吸收的研究[13，29]。

2.2.1 脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs) ADSCs 是來源于脂肪組織的MSCs，因其可自體移植、易獲得、短時間內大量擴增等優勢，被認為是牙周組織再生最有前景的干細胞。干細胞移植處的局部微環境被稱為干細胞生態位，對干細胞的自我更新和分化有重要作用[45]。ADSCs 可分化為成骨細胞[46]，成牙骨質細胞與成骨細胞相似甚至被認為是成骨細胞的亞群，因此有學者猜想ADSCs在合適的環境下可向成牙骨質細胞分化[47-48]。牙囊間充質干細胞與牙根表面未礦化的牙本質基質接觸是牙骨質形成所需的微環境[49]，溫秀杰等[48]在體外將成牙本質非膠原蛋白和牙囊細胞條件培養液混合以模擬牙骨質形成的微環境并培養出有成牙骨質細胞特征的ADSCs。Lemaitre等[29]證實了移植的ADSCs不僅分化為成牙骨質細胞，而且還通過招募內源性成牙骨質細胞前體細胞至牙根表面及促進其分化為成牙骨質細胞而再生牙骨質[50]。同種異體移植和自體移植ADSCs 都可形成新的牙骨質、牙周膜及Sharpey 纖維。ADSCs 再生牙周膜、牙骨質的能力使其對正畸牙根吸收產生影響。ADSCs可通過抑制炎癥、加速牙周膜改建和再生牙骨質來抑制正畸牙根吸。上頜橫向擴弓治療會導致后牙頰傾，而牙齒過度頰側傾斜會導致牙根吸收。Gul Amuk 等[27]建立大鼠快速上頜擴弓模型并向大鼠磨牙周圍移植ADSCs 后減少了大鼠磨牙擴弓期和保持期的牙根吸收，同時增加擴弓期牙移動速率。移植的干細胞通過激活移植部位的駐留干細胞和分泌相關因子介導組織再生效應和免疫調節作用[28]，Gul Amuk等[27]認為移植的ADSCs可能通過降低炎癥標志物COX-2 來減少牙根吸收及分化為成牙骨質細胞或促進牙周MSCs 分化為成牙骨質細胞[20，28]來增加牙骨質厚度、修復吸收的牙根。Gul Amuk等[27]還發現保持期注射ADSCs比擴弓期注射ADSCs對抑制或修復正畸牙根吸略有效，認為若患者進行快速上頜擴弓前存在牙根吸收則首選在保持期內注射ADSCs，因為擴弓期不希望OTM 加速；若擴弓前沒有發生明顯的牙根吸收，則無需進行治療；若需同時加速OTM和預防牙根吸收，則在擴弓期間移植ADSCs。Gul Amuk等[27]還認為移植的ADSCs因代謝需求而加速骨改建，在透明樣組織很少的或沒有的情況下發生牙移動，避免透明樣變的積累，進而減少了牙根吸收。

2.2.2 骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs) BMMSCs可遷移至炎癥和損傷區并促進局部組織修復和再生[51]，外源性BMMSCs在體內可向成牙骨質細胞、成骨細胞和成纖維細胞分化，再生牙骨質、牙槽骨和牙周膜[44，52]。Amuk等[53]在正畸加力期間通過局部注射將其同種異體BMMSCs 移植到大鼠的牙周組織中后不僅牙根吸收陷窩數減少、吸收面積減小，而且牙周組織中RANKL 和COX-2 顯著降低，OPG 的表達顯著增高。Amuk 等[53]認為移植的BMMSCs 不僅通過抑制RANKL-RANK 通路及分化為成牙骨質細胞再生牙骨質而減少了牙根吸收，還發揮其抗炎作用減少破骨細胞和炎癥因子COX-2 來抑制破骨活動而減少了牙根吸收。研究表明OPG 可以促進正畸牙根吸收的修復[54]，Amuk 等[53]移植轉染OPG 基因的BMMSCs 的大鼠產生的吸收陷窩面積和破骨細胞數顯著低于單純移植BMMSCs的大鼠，這表明OPG可抑制牙根吸收，因此OPG 基因聯合MSCs 療法治療正畸源性牙根吸收的效果可能會更理想。雖然OPG 的增加可能會減慢牙移動[33]，但對于正畸治療中發生嚴重牙根吸收的患者而言，需要的是抑制和修復牙根吸收而不是加速牙移動。

2.2.3 尿源性干細胞(urine-derived stem cells，USCs) 用于牙根吸收防治的MSCs 如BMMSCs、PDLSCs、牙囊細胞等細胞[55]需要從骨髓、牙齒、牙槽骨中獲取，方法有創，數量較少。人尿源性干細胞(urinederived stem cells，hUSCs)在2008 年首次從人尿液中分離純化，具有自我更新增殖能力及多向分化潛能[56]，來源廣泛、采集簡單及安全無創，被稱為再生醫學研究理想的“種子細胞”。體外實驗表明hUSCs 可促進成牙骨質細胞株OCCM-30 的增殖和成骨，但作用機制不清[57]。周建萍[55]建立大鼠正畸牙根吸收模型并在其磨牙牙根黏膜處局部注射hUSCs，結果顯示移植的hUSCs遷移到大鼠磨牙牙根周圍，并且通過促進牙根周圍成骨因子的表達及減少破骨細胞數量促進局部成骨，通過減小牙根吸收體積及形成修復性牙骨質來促進牙根吸收的修復。USCs 除自身的分化功能外，還能通過旁分泌機制促進受損組織的修復[58]。顧磊等[59]向大鼠移植的尿源性干細胞外泌體不僅減少了牙根吸收陷窩體積、促進牙根吸收的修復，而且還改善了牙槽骨密度，其機制可能是移植的外泌體上調牙齒及周圍牙槽骨中BMP-2、BSP 的表達來誘導牙周細胞的增殖分化而促進了牙骨質和牙槽骨的形成。正畸牙根吸收由牙周膜前體干細胞分化為成牙骨質細胞并生成牙骨質來修復吸收陷窩。PDLSCs是牙周膜中主要的MSCs，體外可分化為成牙骨質細胞樣細胞，體內可形成Sharpey纖維呈現生理附著的牙骨質/牙周膜樣結構，實現牙骨質的功能性再生[13]。Turkkahraman等[60]發現植入大鼠牙周膜的Wnt反應性干細胞群體后代通過Wnt/β-catenin 途徑直接修復了其生理性牙移動產生的牙根吸。Choi 等[61]證明Wnt/β-catenin 信號通路參與調節成牙骨質細胞分化和牙骨質基質的分泌，可促進牙骨質的形成。因此，PDLSCs和基于Wnt/β-catenin 信號通路的牙周膜Wnt 反應性干細胞再生牙骨質的特性可能會用于正畸牙根吸收的防治。綜上所述，不同來源的MSCs如ADSCs和BMMSCs可以抑制牙根吸收，USCs及其外泌體可修復吸收的牙根，而牙周膜中的干細胞如PDLSCs、Wnt 反應干細胞可能對防治牙根吸收有作用。MSCs可能通過免疫調節減少牙根吸收中的炎癥因子和自身分化為牙骨質形成細胞來減少和修復牙根吸收，但相關機制還需進一步明確。

3 應用外源性MSCs加速牙移動和防治牙根吸收需要考慮的問題

3.1 MSCs的來源 牙源性和非牙源性MSCs都能進行成骨分化和再生牙骨質[6]，都可用于研究加速牙移動和防治牙根吸收，但需考慮治療效果及是否易獲得足夠數量的細胞。針對正畸患者，MSCs 可來源于拔除前磨牙、智齒或乳牙后收集的PDL、牙囊組織，對于非拔牙治療者，其牙齦組織也可提供MSCs[62-63]，這保證了患者可進行自體移植，提高安全性，但MSCs的低免疫原性也使異體移植成為可能。無論自體移植還是異體移植還需考慮MSCs 供體的年齡，研究表明隨著年齡的增加，MSCs的增殖、遷移和多向分化能力降低[64-65]，移植到體內后再生牙骨質和PDL 的能力也會降低甚至缺如[65]。若無法從年輕供體獲得MSCs時，可通過改變局部細胞培養微環境提高MSCs 的增殖分化和組織修復再生能力[66]。

3.2 MSCs 移植的方法、數量及頻率 干細胞移植的修復再生效應與干細胞是否到達組織損傷區域有關，干細胞若不能有效附著于損傷區域則會降低治療效果[67]。MSCs 已廣泛用于研究口腔組織再生，尤其是再生牙周炎破壞的組織。對于牙周缺損的治療，通常是將MSCs 轉移到實驗創建的缺損區，或者是在臨床上通過根分叉區域或牙周手術創造的區域進行移植[68]。但正畸牙根吸收沒有可見缺損，若MSCs 要到達牙根表面需要將MSCs移植到薄而完整的牙周膜中，有研究應用臨床上的浸潤麻醉和牙周韌帶注射法成功將大鼠BMMSCs 轉移至完整的PDL 中[69]。但也有研究通過黏膜下注射法同樣證明移植的hUSCs 到達牙根周圍并且產生治療效應[55]。因此MSCs可通過直接輸送或自身遷移到損傷區域進行組織修復，即使沒有直接植入缺損處的MSCs也可激活缺損處組織的再生修復能力[70]。目前的研究針對不同甚至是相同種類的MSCs，移植的細胞數量不一致[27，53，69]，但針對不同種類的MSCs 需要探究其合適的數量，不是移植的細胞數量越多越好[71-72]。干細胞移植后存活的時間與治療效果有關，Hayashi 等[73]和Robey 等[74]表明移植的MSCs在宿主組織中的壽命較短，大約只有3 d。Hasegawa等[44]認為MSCs移植到牙周缺損處4周內仍有存活并處于不同分化階段。不同種類干細胞移植到不同部位存活時間不同，需要更多的研究來明確，進而確定移植頻率、提高療效。

4 展望

干細胞療法有望成為加速牙移動和防治正畸牙根吸收的有效方法。現有研究表明MSCs 是OTM 骨改建的關鍵細胞，通過促進成骨和破骨活動加速骨改建來加速牙移動。同時，MSCs 的增殖分化潛能和免疫調節功能可通過減輕炎癥、加速牙周膜重塑及再生牙骨質來抑制和修復正畸牙根吸收。但已有研究存在諸多問題，如MSCs 加速牙移動和抑制或修復牙根吸收的相關機制未闡明，MSCs 移植的種類、數量、方法不一致，尚無統一的標準，研究數量少且研究對象局限于動物，需要增加動物研究數量并進行臨床研究。雖然Baba 等[75]表明牙周炎患者自體移植BMMSCs 沒有出現干細胞移植可能帶來的支原體感染、成瘤等不良反應，但干細胞移植的安全性仍需重點關注。解決這些問題后，若干細胞的移植能實現抑制或修復正畸牙根吸收的同時不會減慢牙移動甚至是加速牙移動，那干細胞療法就有望應用于臨床中并為正畸患者帶來福音。