T細胞免疫與WAIHA發病的關聯研究進展

彭薇，宋雅琴，韋愛萍，周秀英，溫謀 綜述 謝政軍 審校

遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院血液內科，廣東 珠海 519100

溫抗體型自身免疫性溶血性貧血(warm autoimmune hemolytic anemia，WAⅠHA)是多種誘因作用下機體產生大量抗自身紅細胞膜蛋白或補體的自身抗體(ⅠgG 型多見)，在37℃左右可與自身紅細胞最大程度結合，繼而發生溶血的一組疾病。根據誘因不同又分為原發性和繼發性，隨著對于更多繼發性免疫異常所致WAⅠHA 的認識，原發性的比例會逐漸下降。WAⅠ-HA是一種罕見疾病，發生率在1/10～3/10萬/年，是自身免疫性溶血性貧血最為常見的類型[1]，70%～80%的成人和50%的兒童自身免疫性溶血性貧血是WAⅠHA[2]。

人們對WAⅠHA 的認識經歷了一個漫長的過程，目前確認WAⅠHA對紅細胞的免疫損傷主要看兩個方面：一是患者的紅細胞體外培養壽命縮短，二是通過DAT和ⅠAT檢測到患者紅細胞上結合有自身抗體和血清中有大量自身抗體，而該抗體是由于異常B淋巴細胞最終分泌產生的，所以很長一段時間以來都認為WAⅠHA 是體液免疫異常所致的自身免疫性疾病。針對這一發病機制的糖皮質激素、人免疫球蛋白、脾切除、其他免疫抑制劑的病因治療雖然可使90%以上的WAⅠHA 得到有效控制。但是多數停藥后又會反復，30%～50%會演變為復發難治型WAⅠHA[3-5]。

這一部分復發難治型WAⅠHA是否有不同的免疫細胞機制？在引起WAⅠHA 發病各個階段都需要T 淋巴細胞及其他免疫輔助細胞參與，這些細胞在WAⅠHA 的發病中扮演什么樣的角色和起到什么樣的作用？近年來人們在這些方面展開了多種研究，本文主要就T 淋巴細胞在WAⅠHA 發病過程中的作用及引起該免疫變化的相關分子通路予以綜述。

1 T細胞在機體免疫調控中的角色及作用

T 細胞激活是一個復雜的過程，需要初級識別信號和共刺激信號等多個細胞信號通路協同作用，是T細胞在機體免疫調控的基礎：

1.1 第一信號 第一信號由抗原遞呈細胞(antigen presenting cell，APC)提供，DC細胞(dendritic cells，DC)是目前發現唯一能啟動初始T 淋巴細胞應答的APC，起著鏈接先天免疫和適應性免疫的重要作用，當因體內或環境溫度達37℃自身細胞發生免疫耐受失衡或因病毒感染而發生抗原性改變時，未成熟的DC細胞被激活，其表面的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)與T細胞抗原受體相結合，隨DC細胞移位至二級淋巴器官。成熟的DC細胞高表達內源性MHCⅠ類和外源性MHCⅡ類分子，分別激活CD8+T 細胞，介導抗原特異性細胞毒性效應；以及激活CD4+Th 細胞，介導輔助T 細胞效應，為T 細胞提供了第一信號[6-7]，從細胞免疫方面提升機體的抗感染能力。

1.2 第二信號 當T細胞與抗原相遇后，共刺激信號分子的存在為T細胞活化提供了第二信號，當DC細胞在移行過程中可高表達B7 蛋白，主要分為B7-1(CD80)和B7-2(CD86)兩類抗體，可分別與Ⅰg 超家族成員CD28 及CTLA-4 相結合[8]，促使T淋巴細胞增殖及ⅠL-2因子的分泌，控制著T 細胞的初始啟動和分化等許多方面[9-10]；若缺失則會使T 細胞呈失能狀態，特征性地表現為T細胞不能進行增殖或合成ⅠL-2，繼而導致無法產生正常的免疫反應，阻斷該途徑可能為未來治療T 細胞介導的自身免疫性疾病的有效方法之一[11]。另外CD69 為近年來共刺激信號的研究熱點，具有早期活化誘導Th細胞的作用，能加速其增殖并破壞機體免疫耐受，驅使T細胞募集至炎癥部位，啟動紅細胞殺傷功能。邢莉民等[12]和董敏等[13]的研究發現，CD4+CD69+T高表達于AⅠHA患者外周血中，并與疾病嚴重程度呈明顯負相關；劉波等[14]通過回顧性分析研究發現，AⅠHA患者外周血中CD4+CD69+T細胞占比經臨床治療后顯著下降，預示其與病情的嚴重程度密切相關，可作為AⅠHA治療后療效評估監測的指標。

1.3 第三信號 在第一信號和第二信號的基礎之上，第三信號即細胞因子的參與使T 能力得到完全發揮，如ⅠL-1 與抗原協同使CD4+T 細胞活化，ⅠL-2 可使表達高親和力ⅠL-2Rα亞基的調節性T 細胞有效擴增[15]，ⅠL-7 與ⅠL15 協同維持記憶性T 細胞的生存，ⅠL-12 和ⅠFNα/β使CD8+T 細胞具有對各種體內刺激作出反應的能力[16]，ⅠL-21 作為Th17 細胞的自分泌生長因子發揮免疫調節作用[17]等。

2 T細胞免疫失衡是WAIHA發病的主要環節

T細胞在被三種類型的信號共同激活活化后募集至炎癥部位，輔助T 細胞(helper T cell，Th)、調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)及細胞毒性T 細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL/cytotoxic T cell，Tc)發揮免疫調節作用，是既往學者研究及治療的主要機制。

2.1 Th 細胞在WAⅠHA 發病機制中的作用 Th在成熟DC 細胞的刺激影響下分化成不同亞群，其間協同或制約失調與WAⅠHA的發病密切相關。

2.1.1 Th1/Th2 Th1 和Th2 是Th 細胞中的重要調節亞群，其中Th1 主要分泌ⅠL-12、ⅠFN-γ、TNF-β，可激活巨噬細胞、誘發遲發型超敏反應和清除胞內病原體；Th2 細胞能夠分泌ⅠL-4、ⅠL-5、ⅠL-6、ⅠL-10、ⅠL-13，具有激活體液免疫、促進抗體生成的作用；Th1 與Th2 細胞相互制約，當平衡破壞后，即會導致免疫疾病的發生和發展[18]。Fagiolo 等[19]的實驗表明AⅠHA中基礎ⅠL-4、ⅠL-10 合成增加和ⅠFN-γ、ⅠL-12 水平降低，導致Th1 細胞因子衰減，Th2 細胞因子亢進，Th1/Th2 平衡紊亂。陶叔超[20]在對AⅠHA 患者的臨床研究中發現，利妥昔單抗可通過上調T 淋巴細胞改善Th1/Th2平衡狀態，達到治療貧血目的。

2.1.2 Th17 Th17 細胞具有分泌大量炎癥介質ⅠL-17A 的特性，可通過分泌ⅠL-17A、ⅠL-17F、ⅠL-21和ⅠL-22 等促炎性因子作用于上皮細胞和內皮細胞、成纖維細胞、中性粒細胞和單核/巨噬細胞等多種細胞細胞，介導炎癥的發生[21]。Hall等[22]通過實驗發現AⅠ-HA 患者外周血中ⅠL-17A 水平較健康對照組顯著升高，與血紅蛋白呈顯著負相關，提出誘導Th17 細胞因子表位應作為AⅠHA 的治療靶點。Xu 等[23]建立馬歇爾-克拉克和普萊費爾模型誘導B6 小鼠患AⅠHA，實驗說明Th17細胞與AⅠHA的疾病活動密切相關，并參與了該病的發生發展，起著主要驅動因素。

2.1.3 Tfh和Tfr T 濾泡輔助細胞(follicular helper T，Tfh)和T 濾泡調節(follicular regulatory T，Tfr)細胞是淋巴濾泡生發中心中輔助B淋巴細胞產生自身抗體的核心。Tfh獨立于Th1、Th2、Th17分化，主要通過ⅠL-21R 發揮作用，具有輔助B 細胞產生抗體的作用；Tfr細胞具有Tfh和Treg細胞的共同特征。Gao等[23]通過實驗發現AⅠHA 小鼠模型中的CD4+CXCR5+CD25-Tfh 細胞數量增加，導致Tfh∶Tfr 的比率高，且增加的Tfh 細胞活性與紅細胞的免疫反應相關，提示Tfh細胞在AⅠHA發病機制中發揮作用。

2.2 Tregs 在WAⅠHA 發病機制中的作用 Tregs是維持機體免疫耐受的重要細胞，維護了機體正常免疫反應，是學者研究WAⅠHA 等自身免疫性疾病的重點機制[24]。Tregs屬于免疫抑制性細胞，膜表面表達的CD25+、CD4+和核內表達的叉頭盒蛋白3 轉錄因子共同組成細胞的標記物并分泌TGF-β、ⅠL-10 等細胞因子，發揮負性調節的重要作用。在Tregs 的表達機制中，當CD25+表達時，可結合并清除增殖細胞因子ⅠL-2，Foxp3 則充當Tregs 表達的主調節因子[25]。Toomer等[26]通過分子敲除模型說明，若CD25 或Foxp3 缺失，Tregs 則出現調節異常，可引起自身免疫性疾病發生。肖捷等[27]通過檢測患者外周血發現，AⅠHA 初治組及復發組Tregs 比例較完全緩解組及健康對照組均低，提示Tregs 與AⅠHA 患者的細胞免疫紊亂可能有關。Kumar等[28]的實驗表明增強調節性T細胞可恢復自身免疫性疾病中的自我耐受性。另外，隨著近年來研究條件的優化，學者也開始研究CD8+Tregs 在AⅠHA 中的調節機制，在人體中主要表型有CD8+CD28-Foxp3+、CD8+CD45R+Clow、CD8+CXCR3+等。CD8+CD28-Foxp3+的研究較為深入，它是一個獨特的Tregs亞群，可誘導活化CD4+T 細胞調亡，并降低CD25 和CD69 的表達水平，另一方面細胞毒性細胞的減少也被認為是通過誘導效應細胞凋亡來抑制Tregs的另一種機制，目前在再生障礙性貧血性貧血[29]、特發性血小板減少性紫癜[30]中研究較多，這可能成為將來研究WAⅠHA的方向之一。

2.3 CTL/Tc 在T 細胞的調節中，除Th 細胞和Treg 細胞發揮著至關重要的作用，細胞毒性T 細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL/cytotoxic T cell，Tc)與Th細胞的動態變化也是研究者關注的機制之一。在CTL 中發揮主要作用的是CD8+，其不僅充當表面標志，并且具有抑制T 細胞活化和B 細胞產生抗體的功能，在體液及細胞免疫中發揮重要效應。既往學者研究兩者的平衡調節主要是通過研究CD4+/CD8+比例變化，間接反映了機體的免疫功能狀況。研究發現，AⅠHA 患者CD4+T 百分率及CD4+/CD8+比例均顯著降低，可能存在T 細胞免疫功能低下，而CD4+亞群Th1/Th2、CD8+亞群Tcl/Tc2 的失衡，Th2 細胞功能異常及ⅠL-2、ⅠFN-γ、ⅠL-4、ⅠL-5、ⅠL-10 等細胞因子的異常分泌也有發揮作用[31-32]。

3 影響WAIHA發病中T細胞免疫紊亂的重要分子通路

T 細胞的生成有許多重要的信號通路也參與其中，目前已知機制主要是通過Tregs 和Th17 等T 細胞的上游影響著免疫調節。

3.1 CD28/CTLA-4 共刺激信號通路 CD28/CTLA-4 是T 細胞上的最典型的共刺激信號通路之一，其與共刺激分子CD80和CD86形成兩個嵌套的拮抗反饋回路，主要通過調節CD4+Th 的激活和增加Tregs 來調節T 細胞激活。其中CTLA-4 分子組成性表達于Tregs，表明CTLA-4在維持T 細胞穩態和耐受性方面具有效應T細胞內在作用，是Treg 功能所必需的。Wing 等[33]通過小鼠實驗發現，當Tregs 中特別缺乏CTLA-4 時，小鼠可死于致命的淋巴組織增生性疾病，類似于在全部CTLA-4 KO 動物中看到的疾病。Krummey 等[34]通過小鼠實驗研究證明了該反饋回路可微調Th1 和Th17 細胞反應，減少極化Th17 細胞的數量，為WAⅠHA的T細胞功能影響提供了研究方向。

3.2 Ca2+-Calcineurin-NFAT通路 NEFT家族是活化的T 細胞核內因子(nuclear factor of activated Tcells，NFAT)，為Ca2+的下游通道之一，可引導幼稚的CD4+T 細胞分化成不同的效應T 細胞亞群，在NFAT中，NFAT1～4 均由Ca2+激活，每種因子的作用效應不同，但均對T細胞具有調節作用，是T細胞的發育和成熟過程所必需的一部分。Ghosh 等[35]研究表明，活化NFAT1 在Th17 的ⅠL-17 和ⅠL-10 的轉錄上調中起直接作用，且充當T 細胞激活下游多個不同途徑(Th1/Th2/Th17/Treg)的看門人，其過度活化可能是WAⅠHA的發病機制之一。Lozano 等[36]研究表明Treg 分化是通過NFAT的抗原刺激啟動的，Foxp3必須與NFAT形成合作復合物才能與靶基因結合，來發揮免疫作用，FOXP3/NFAT1 相互作用可以增強T 細胞免疫。而Jyothi等[37]的研究表明，NFAT2的缺乏可引起ⅠL-4和Th2分泌減少，使ⅠgE和ⅠgG1抗體滴度下降，這些研究提示NFAT途徑可能在WAⅠHA的發病中發揮一定作用。

3.3 JAK/STAT 通路 Janus 激酶/信號轉導和轉錄激活子(janus kinase/signal transducer and activator oftranscription，JAK/STAT)通路幾乎介導所有的免疫調節過程，STAT 因子被確定為多種途徑的關鍵節點[38]，該通路的活化決定了T細胞的分化方向，其中STAT3 蛋白過表達可誘導Th17 分化及磷酸化抑制Tregs 的發育和ⅠL-2 的產生，而STAT5 蛋白在Treg 細胞前體的Foxp3誘導中起重要作用，過量的ⅠL-2 信號使STAT5磷酸化，它與Foxp3位點結合并誘導Tregs過表達，引起Th17/Treg失衡[39]，可能成為WAⅠHA發病原因之一。

3.4 PⅠ(3)K/Akt/mTOR通路 PⅠ(3)K/Akt/mTOR級聯構成ⅠL-2 下游的主要信號通路，與Tregs 代謝穩定性和抑制功能密切相關[40]。當PD-1 與其配體結合可阻斷T細胞信號分子CD28介導的PⅠ(3)K通路，抑制T細胞的增殖和分化[25]。miR-15b/16通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋PⅠ(3)K-Akt 通路，上調Tregs 的表達和其抑制功能[41]，說明了該通路與T細胞的調節密切關聯。另外還有一些轉錄因子如c-Rel、Smad2/3、ATF、AP-1和Nr4a 也參與了Foxp3 的表達，可能與WAⅠHA的發病有關，但目前相關研究較少，可作為未來WAⅠHA疾病機制進一步研究的方向。

4 其他免疫輔助細胞分子在WAIHA 發病機制中的作用

除了T 細胞的自身及分子通路的調節之外，還有一些其他免疫輔助細胞分子在WAⅠHA的發病中也有著不可或缺的作用。

4.1 單核-巨噬細胞系統 WAⅠHA 患者機體在37℃時，單核細胞表面的不同Fc 受體(Fc receptors，FcR)結合致病性ⅠgG，誘導單核細胞分化成巨噬細胞，吞噬清除被致敏和包被的紅細胞，引起溶血性貧血的發生[42]。其中FcγRⅠ與FcγRⅡa 含有免疫受體酪氨酸活化基序，FcγRⅡb則起著抑制作用，FcγRⅢ具有低親和力使免疫性疾病的易感性增加。Sietse 等[43]通過檢測AⅠHA 病例不同組織中FcγR亞型的表達，發現與外周血單核細胞相比，紅髓巨噬細胞主要表達低親和力受體FcγRⅡa 和FcγRⅢa，不表達抑制性FcγRⅡb，并且表達高親和力受體FcγRⅠ，這可能具有治療意義，因為FcγR及其信號傳導最近已成為自身免疫性疾病的方向。

4.2 CD47 信號 為平衡Fc 受體介導的吞噬作用，紅細胞膜上存在一種普遍表達的跨膜蛋白CD47，被研究者認為是一種“別吃我”的信號通路和先天免疫檢查點，在紅細胞穩態中起著至關重要的作用[44]。CD47與巨噬細胞以及其他骨髓細胞上存在抑制性受體信號調節蛋白α(SⅠRPα)結合，將細胞標記為“自我”，使紅細胞產生自我保護作用。當炎癥、感染等發生時，TSP-1 與CD47 相結合，為SⅠRPα創建一個新的結合位點，轉化成“吃我”的信號，可將紅細胞從循環中清除[45]。Sanne M 通過F (ab') 2 阻斷CD47 抗體，確定了CD47 在ⅠgG 介導的脾臟RBC 吞噬中的作用，驗證了ⅠgG 調理作用和CD47 是吞噬作用的主要平衡決定因素。并發現AⅠHA 患者紅細胞中存在CD47 表達的缺失，比健康對照組的紅細胞更容易被吞噬，考慮是患者的紅細胞除了增強中性粒細胞(例如補體)的吞噬作用外，還具有額外的“吃我”信號，加重溶血的發生[46]。

5 結語

WAⅠHA 是一組以自身紅細胞溶解破壞為主的溶血性貧血，周期性、間斷性體內抗紅細胞膜抗體升高致敏紅細胞是溶血發生的主要始動因素。現有的治療手段通過切斷自身抗體與紅細胞結合、抑制產生抗體的B淋巴細胞可以有效控制大部分的WAⅠHA，但是仍有30%左右的WAⅠHA 演變成復發難治型WAⅠHA，成為困擾臨床的難題。

于是人們開始思索以上對于WAⅠHA發病機制的認識可能只是“冰山一角”，背后還有T淋巴細胞作為推手在WAⅠHA尤其是復發難治型中發揮作用。近年來圍繞T 細胞的系列研究似乎揭示了WAⅠHA 發病過程中的重要病理節點，今后通過對這些關鍵病理節點的控制及阻斷可能為WAⅠHA的治療帶來希望和革新。