血清NT-proBNP、miR-431對川崎病伴冠狀動脈損害的預測價值

王曉微, 付迎新, 趙淑清, 趙春華, 徐穎奇

(北京懷柔醫院兒科, 北京 101400)

川崎病(Kawasaki disease,KD)又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征,是一種急性自身免疫性疾病[1]。血管損傷,包括冠狀動脈損傷,是KD的主要并發癥之一,且KD現在已成為兒童獲得性心臟病的主要病因之一,與成年后發生缺血性心臟病事件關系密切[2]。但由于KD臨床表現與兒童時期的其他發熱性疾病難以區別,其早期診斷仍然十分困難,臨床中迫切需要新的特異性診斷生物標志物。MicroRNAs(miRNAs)是一種小的非編碼RNA,長度約為21～25個核苷酸。通過與信使核糖核酸分子的互補結合,miRNAs可作為引導分子以多種方式下調基因表達[3]。MicroRNAs參與調節機體不同的發育階段和病理過程。miRNAs以一種非常穩定的形式存在于人體血液中,并受到內源性核糖核酸酶(Ribonuclease, RNase)活性的保護[4]。研究發現,KD患者血清中miR-200C、miR-371-5P表達水平與患兒炎癥水平顯著相關[5];急性KD患者血液中miR-145呈高水平表達[6]。N末端B型利鈉肽(N-terminal B-type natriuretic peptide, NT-proBNP)是由心肌細胞在外界刺激下產生的由32個氨基酸殘基組成的多肽,其半衰期可達120 min,在體外表達水平相對穩定[7]。NT-proBNP對急性心力衰竭的診斷和預后判斷有重要意義。在KD急性期,NT-proBNP水平急劇升高,是目前較為公認的KD診斷標志物[8]。本研究通過檢測KD患兒外周血NT-proBNP和miRNA水平,探討二者聯合檢測對KD合并冠狀動脈損害的診斷價值,以期為臨床KD伴冠狀動脈損害的診斷提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2018年1月-2021年8月北京懷柔醫院收治的選擇168例KD患兒為研究對象(KD組),根據心臟超聲結果,將KD組進一步分為冠狀動脈損害組(CAL組,n=32)和非冠狀動脈損害組(NCAL組,n=136)。同時,根據性別和年齡匹配原則,選擇同期北京懷柔醫院收治的170例上呼吸道感染患兒為對照組(NC組)。納入標準:(1)KD患兒均符合美國心臟協會(American Heart Association, AHA)2017發表的關于KD的診斷標準;(2)首次診斷并治療;(3)臨床資料完整。排除標準:(1)合并其他自身免疫性疾病;(2)合并惡性腫瘤或感染性疾病;(3)采血前2周接受了激素、免疫抑制劑等治療。所有監護人對本研究知情同意。本研究獲北京懷柔醫院倫理委員會批準,審批號:京懷倫科字(2023)第(03)-02號。

1.2 血液指標檢測在靜脈注射免疫球蛋白G治療前采集患兒外周血樣本,用乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝,在3 000 r/min、4℃條件下離心5 min,收集血清,并將其儲存在-80℃。SYSMEX XE-2100 (F5192) 全自動血液分析儀檢測白細胞計數(White blood cell count,WBC)、血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)、血小板計數(Platelet count,PLT);Roche modular DPP全自動生化儀檢測C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、NT-proBNP、谷丙轉氨酶(Alanine transaminase,ALT)、白蛋白(Albumin,ALB)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL);ALIFAX MICRO TEST1 血沉儀測定血沉(Erythrocyte sedimentation rate,ESR)。

1.3 下一代測序使用NanoPhotometer?分光光度計、Qubit?2.0熒光光度計和Agilent 2100 RNA Nano 6000分析試劑盒從患兒血清中提取總RNA。使用NextSeq測序平臺上的SE50測序程序對合格的DNA文庫進行測序,以獲得高質量的序列讀數。通過Bowtie對數據進行清理并與參考基因組進行比對,并使用miRDeep2軟件鑒定miRNAs。DESeq分析得到差異表達的miRNAs,篩選標準為Q值<0.05,|log2foldchange|>1。

1.4 RNA提取及RT-PCR檢測提取總外周血RNA?；パa脫氧核糖核酸用M-Mul V逆轉錄酶在凸環miRNA-501、miRNA-520d-5p、miRNA-200、miRNA-15b和miRNA-451引物作用下合成。定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction,QPCR)使用SYBR 試劑在CFX96實時PCR檢測系統上進行,PCR反應重復進行3次。PCR反應條件為95℃變性20 s,然后95℃變性10 s,60℃變性20 s,70℃變性10 s,共40個循環。用U6對qPCR數據進行歸一化處理。

2 結果

2.1 KD組與NC組的臨床特征比較與NC組比較,KD組的WBC、PLT、CRP、ESR、ALT、NT-proBNP水平均較高,而HDL水平較低,差異有統計學意義(P<0.05)。但兩組患兒的性別、年齡、Hb及ALB水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 CAL組與NCAL組患兒臨床特征比較CAL組與NCAL組的性別、年齡、WBC、PLT、CRP、ALB、HDL、淋巴結腫大及手足硬腫發生率比較,差異無統計學意義(P>0.05);與NCAL組患兒比較,CAL組患兒Hb、ESR、ALT、NT-proBNP水平顯著較高,且發熱時間明顯更長,皮疹、結膜充血的發生率也更高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 CAL組與NCAL組患兒臨床特征比較

2.3 兒童外周血miRNA表達譜鑒定與NC組兒童比較,KD患兒外周血共檢測到149種差異表達的miRNAs,其中113種表達上調,36種下調(圖1a)。層級聚類(圖1b)顯示,NC組與KD組患兒的miRNA圖譜明顯不同,10種miRNAs顯著上調,3種miRNAs下調(P<0.05),表達水平差異≥2倍。其中,miR-100a、miR-431、miR-203分別上調3.4倍、3.1倍、2.9倍,是變化最為顯著的miRNA。進一步行亞組分析發現,CAL組及NCAL組患兒外周血56種差異表達的miRNAs,其中42種表達上調,14種表達下調,其中,miR-431、miR-204-5p、miR-34a分別上調1.9倍、1.6倍和1.4倍,是變化最為顯著的miRNA。最終,選擇miR-431為進一步研究指標。

圖1 下一代測序分析患兒外周血中差異表達的miRNAs圖

2.4 患兒外周血差異性表達miRNAs的驗證隨機挑選5個miRNAs,即miRNA-501、miRNA-520d-5p、miRNA-200、miRNA-15b和miRNA-451,采用RT-PCR法檢驗5種miRNA在KD組和NC組患兒外周血的表達水平。PCR結果顯示,與NC組比較,KD組患兒外周血miRNA-501、miRNA-520d-5p、miRNA-200表達水平明顯升高,miRNA-15b、miRNA-451表達水平明顯下降,與下一代測序結果一致。提示測序結果可靠。與NCAL組比較,CAL組患兒外周血miRNA-501、miRNA-520d-5p、miRNA-200表達水平明顯升高,miRNA-15b、miRNA-451表達水平明顯下降(P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 RT-PCR檢測兩組患者外周血中差異表達的miRNAs圖

表3 CAL組、NCAL組患兒差異表達miRNAs水平比較

2.5 患兒外周血NT-proBNP與miR-431表達的相關性CAL組、NCAL組患兒外周血中NT-proBNP與miR-431表達均呈正相關(r=0.765、0.536,P=0.003、0.018)。見圖3。

圖3 患兒外周血NT-proBNP與miR-431表達的相關性散點圖

2.6 影響冠脈損傷發生的logistic多因素分析以是否發生冠狀動脈損害為因變量,以各項檢查結果為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,發熱時間、NT-proBNP、miR-431均是影響KD患兒發生冠狀動脈損害的獨立性危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響冠脈損傷發生的Logistic多因素分析

2.7 NT-proBNP、miR-431對KD合并冠脈損傷的診斷價值ROC曲線顯示,NT-proBNP、miR-431對KD合并冠脈損傷診斷的曲線下面積(Area under curve,AUC)分別為0.645、0.659,診斷敏感性分別為0.684、0.733,特異性分別為0.765、0.721,當二者聯合檢測時,可將AUC提高至0.799,見圖4和表5。這表明,二者聯合檢測對KD合并冠脈損傷有較高的診斷價值。

3 討論

KD會加速冠狀動脈粥樣硬化,甚至可能發生急性冠脈綜合征和猝死[9]。miRNAs作為多種疾病的潛在生物標記物,例如miR-122-5p、hsa-miR-141-3p和hsa-miR-26b-5p對原發性膽汁性肝硬變具有較高的診斷準確性[10]。有研究報道,miR-92a-3p可能是區分KD與健康兒童的良好生物標志物[11]。

本研究結果顯示,與NC組比較,KD組外周血miR-100a、miR-431、miR-203分別上調3.4倍、3.1倍、2.9倍,是變化最為顯著的miRNA。與NCAL組比較,CAL組外周血miR-431、miR-204-5p、miR-34a分別上調1.9倍、1.6倍和1.4倍,是變化最為顯著的miRNA。miR-431在各組患兒外周血的表達水平均有較高的區分度。研究表明,miR-431廣泛了參與細胞凋亡、內皮型一氧化氮合酶表達和炎癥等生物學過程[12];在動脈粥樣硬化區域,氧化型低密度脂蛋白可上調miR-431表達促進內皮激活和動脈粥樣硬化病變的發展[13]。提示,循環miR-431可能促進KD合并冠狀動脈損害的發生。

心肌缺血、壞死、損傷、室壁張力和壓力超負荷均可刺激心肌細胞大量釋放前ProBNP,ProBNP被切割成proBNP和一個信號肽,前者移位到血液中,進一步被切割成NT-proBNP和BNP[14]。NT-proBNP具有較長的半衰期和較高的血藥濃度穩定性,適合用于臨床檢測。研究表明,NT-proBNP水平能調節動脈粥樣硬化的發展[15]。本研究的結果與上一致,miR-431和NT-proBNP表達呈正相關,且在KD患兒血清中表達上調。

綜上所述,血清miR-431作為一種新的潛在生物標志物,與NT-proBNP聯合檢測對預測急性KD患兒是否發生冠狀動脈損害具有較高的敏感性和特異性,可作為KD的一種新的生物標志物,并可能成為未來治療的新靶點。