多房棘球絳蟲基因組DNA三種提取方法的比較

王明坤, 孜比姑·肉素, 李德偉, 余 倩, 李 靜, 張傳山,2, 王 慧,2

(1新疆醫科大學基礎醫學院, 烏魯木齊 830017; 2新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院, 烏魯木齊 830054)

包蟲病(棘球蚴病),是一種嚴重危害人民身體健康和阻礙社會經濟發展的人獸共患寄生蟲病,已成為全球性的公共衛生問題[1]。其中,由多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis,E.m)幼蟲感染引起的泡型棘球蚴病(Alveolar echinococcosis,AE)呈惡性侵襲性生長,病灶類似緩慢生長的肝癌,俗稱“蟲癌”,病死率高[2-4]。研究表明,不同地域來源的E.m蟲株對宿主的致病能力和器官的損傷程度不同[5-6]。然而,棘球絳蟲蟲株變異范圍廣,從蟲株本身的基因型差異對蟲株進行明確分型并分析不同蟲株間的遺傳變異差異,從而找到不同蟲株致病的“關鍵毒力因子”,將對研制疫苗、診斷抗原和治療藥物有重大意義。目前,通過有效提取不同地域來源的E.m蟲株樣本中的基因組DNA,進行核基因延伸蛋白樣蛋白(Ezrin/radixin/moesin-like protein,elp)、線粒體相關基因細胞色素b(Cytochrome b,cob)、NADH 脫氫酶亞基2(NADH dehydrogenase subunit 2,nad2)和細胞色素c氧化酶亞基I(Cytochrome c oxidase subunit 1,cox1)片段的有效擴增和測序分析,定義了18個E.m單倍體基因型[7]。因此,提取高質量的E.m蟲體樣本基因組DNA對后續高效擴增elp、cob、nad2和cox1基因進行準確蟲株分型至關重要。本研究通過使用95℃水浴法、堿裂解法及離心柱法提取E.m原頭節(Protoscoleces,PSCs)和囊壁組織樣本中的基因組DNA,并進行濃度、A260/A280比值及elp、cob、nad2和cox1基因擴增效果的綜合比較,以期篩選出適宜高效擴增E.m線粒體相關基因的基因組DNA提取方法,使得蟲株基因型鑒定更加準確和穩定,為進一步開展E.m分子遺傳學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器、設備與試劑Nano Drop-1000微量核酸濃度測定儀(Thermo 公司,美國),DYY-6D電泳儀(北京六一生物科技有限公司),高速冷凍離心機(Eppendorf 公司,德國),DK-88恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司),Thermal Cycler PCR擴增儀以及GelDoc XR+凝膠成像系統(Bio-Rad公司,美國),組織基因組DNA提取試劑盒(江蘇康為世紀生物科技股份有限公司,貨號:CW2298M),核酸染料(百泰克生物技術有限公司),2×Taq Master Mix(Biomiga公司,美國)、DL2000 Marker和5×TBE(上海生工生物工程股份有限公司),蛋白酶K(江蘇康為世紀生物科技股份有限公司),氫氧化鈉和三羥甲基氨基甲烷均為國產分析純試劑,引物由上海生工合成。

1.2 實驗動物、多房棘球絳蟲組織樣本收集使用3只SPF級保種小鼠,飼養于新疆醫科大學實驗動物中心,無菌條件下取小鼠腳趾和鼠尾組織置于1.5 mL離心管中凍存備用。參照文獻[8],無菌條件下分離多房棘球蚴保種鼠腹腔中的病灶組織,置于100 目的鋼網上剪碎并進行研磨過濾,收集的原頭節用生理鹽水洗滌3～5次,取15 μL蟲體沉淀于1.5 mL離心管中凍存備用;取部分囊壁組織研磨后置于1.5 mL離心管中凍存備用。

1.3 基因組DNA提取分別采用95 ℃水浴法、堿裂解法及離心柱法等3種方法提取多房棘球絳蟲原頭節、囊壁蟲體組織樣本基因組DNA;采用離心柱法提取小鼠組織樣本基因組DNA。

1.3.1 95℃水浴法提取 參照文獻[9],取15 μL蟲體沉淀,加入30 μL蛋白酶K,渦旋震蕩混勻,56℃水浴鍋過夜;次日取出樣本短暫離心后放入95℃水浴鍋10 min; 從水浴鍋中取出,冷卻2 min后, 12 000 r/min離心5 min,上清為基因組DNA,-20℃保存備用。

1.3.2 堿裂解法提取 取15 μL蟲體沉淀,加入100 μL,50 mmol/L的氫氧化鈉(NAOH)溶液混勻,于干式恒溫加熱器中95℃加熱30 min,加入8.3 μL,1 mmol/L 的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(Tris-HCL)混勻,6 000 r/min離心5 min,上清為基因組DNA,-20℃保存備用。

1.3.3 離心柱法提取 分別取15 μL蟲體沉淀和研磨后的囊壁組織,嚴格按照組織基因組DNA離心柱法提取試劑盒說明書進行DNA提取,洗脫收集的基因組DNA,-20℃保存備用。

1.4 基因組DNAA260/A280 比值和濃度的測定分別取2 μL上述3種方法提取的基因組DNA樣本,使用 Nano Drop-1000微量核酸濃度測定儀測定基因組DNA濃度和A260/A280比值,瓊脂糖凝膠電泳檢測比較3種方法提取的基因組DNA的質量。

1.5 多房棘球絳蟲線粒體相關基因的PCR擴增參考文獻[7,10]合成擴增E.m線粒體基因(cob,nad2和cox1)及核基因elp片段的引物(表1)。PCR反應體系(20 μL):2×Taq PCR Master Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,基因組DNA模板2 μL(250 ng),焦碳酸二乙脂(DEPC)水補足至20 μL;PCR反應條件:94℃,90 s;94℃,30 s;62℃,30 s;72℃,1～3 min,其中elp(1 min),cob、nad2(2 min 30 s),cox1(3 min),11個循環,每個循環退火溫度下降1℃;94℃,30 s;55℃,30 s;72℃,1～3 min,其中elp(1 min),cob、nad2(2 min 30 s),cox1(3 min),24個循環;72℃延伸5 min。并以提取的小鼠組織基因組DNA作為對照,取5 μL PCR擴增的產物進行1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 不同方法提取PSCs基因組DNA濃度、A260/A280比值和線粒體基因擴增效果比較3種方法提取的PSCs基因組DNA濃度分別為,95℃水浴法(1 090.14±118.51)ng/μL、堿裂解法(201.48±6.11)ng/μL和離心柱法(87.17±8.97)ng/μL;A260/A280比值分別為(1.14±0.02)、(1.41±0.01)和(1.85±0.28),離心柱法提取的DNAA260/A280比值顯著高于95℃水浴法和堿裂解法(F=15.10,P<0.01)。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,離心柱法提取的PSCs基因組DNA無降解、無RNA或蛋白質等成分污染,而95℃水浴法和堿裂解法提取的DNAA260/A280比值低,存在殘留蛋白質等成分污染導致電泳遷移較慢(圖1)。以3種方法提取的PSCs基因組DNA為模板,擴增elp、cob、nad2和cox1基因片段結果顯示,在加樣模板總量一致的情況下,3種方法提取的DNA均可擴增出核基因elp(68 bp)的目的條帶,且以離心柱法提取的DNA為模板擴增的條帶最亮;95℃水浴法和堿裂解法提取的DNA只有效擴增出線粒體cob(1 068 bp)基因,nad2(882 bp)和cox1(1 608 bp)基因擴增效果不佳,而離心柱法提取的DNA可同時有效擴增出三個線粒體基因,且電泳條帶清晰、明亮,片段長度準確(圖2)。

A,基因組DNA吸光值曲線;B,基因組DNA濃度;C,基因組DNA A260/A280比值;D,3種方法提取PSCs基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳(Lane M,DNA 8 000 marker;Lane1,95℃水浴法;Lane2,堿裂解法;Lane3,離心柱法); *P< 0.05; **P<0.01; ***P<0.001。

注:Lane M, DNA 2 000 marker; Lane 1～3,95℃水浴法提取的基因組DNA模板;Lane 4～6,堿裂解法提取的基因組DNA模板;Lane 7～9,離心柱法提取的基因組DNA模板。

2.2 蟲體不同組織樣本中基因組DNA的濃度、A260/A280比值和線粒體基因擴增效果比較基于上述結果,選取能夠有效提取并擴增線粒體相關基因的離心柱法來提取PSCs和囊壁組織中的基因組DNA。結果顯示,從囊壁組織中提取的DNA濃度(190.03±136.19)ng/μL高于從PSCs中提取的DNA濃度(40.95±19.45)ng/μL,但差異無統計學意義(t=1.46,P>0.05);囊壁組織基因組DNAA260/A280比值(1.42±0.38)低于PSCs基因組DNAA260/A280比值(1.69±0.03),差異無統計學意義(t=0.95,P>0.05)(圖3)。分別以提取的PSCs和囊壁組織基因組DNA為模板,擴增elp、cob、nad2和cox1基因片段結果顯示,PSCs基因組DNA可擴增出全部目的基因片段,而囊壁組織基因組DNA僅擴增出elp基因,線粒體基因cob、nad2和cox1均未得到有效擴增(圖4)。為排除宿主來源的細胞對結果可能的影響,進一步提取宿主(小鼠)組織的基因組DNA,并以其為模板同時擴增蟲體elp、cob、nad2和cox1基因片段結果顯示,以PSCs基因組DNA為模板可擴增出蟲體全部目的基因片段,而以小鼠組織基因組DNA為模板未擴增出任何蟲體的目的基因片段(圖5)。

注:A,基因組DNA吸光值曲線;B,基因組DNA濃度;C,基因組DNA A260/A280比值。

注:Lane M,DNA 2 000 marker; Lane1～2,PSCs的基因組DNA模板;Lane 3～4,為囊壁的基因組DNA模板;Lane 5,為陰性對照。

3 討論

流行病學調查和基礎研究資料表明,不同地域來源的多房棘球絳蟲蟲株在遺傳特性、致病力和宿主選擇上有較大差異[5,7]。線粒體基因的遺傳差異是導致寄生蟲致病差異的主要原因,也是不同蟲株分型的主要標志[11-12]。目前,主要通過采用PCR擴增獲得蟲體線粒體DNA基因序列(如:cob、nad2和cox1),比對分析基因序列的差異,進而對各蟲株進行分型[7, 13-15]。寄生蟲基因組DNA提取的質量與線粒體基因的有效擴增密切相關。因此,篩選適宜的基因組DNA提取方法對后續蟲株的準確分型尤為重要。

本研究使用95℃水浴法、堿裂解法及離心柱法分別從分離的PSCs樣本中提取基因組DNA,從提取的基因組DNA濃度、A260/A280比值和擴增多房棘球絳蟲核基因elp及線粒體基因cob,nad2和cox1的效果進行綜合比較,發現3種方法提取的基因組DNA質量存在明顯差異。其中,95℃水浴法提取的DNA濃度最高,A260/A280比值最低;離心柱提取的DNA濃度最低,A260/A280比值最高;堿裂解法提取的DNA的濃度和A260/A280比值介于二者之間。3種方法均能擴增出elp基因,表明均能夠從PSCs中提取出蟲體基因組DNA,但只有離心柱法提取的DNA能夠全部有效擴增出蟲體的3個線粒體基因。95℃水浴法和堿裂解法提取的DNA僅能有效擴增出cob基因。其原因可能是95℃水浴法是先在樣本中加入蛋白酶K,可酶解與核酸結合的組蛋白,提高了對蟲體的裂解效率,因此獲得的DNA濃度高,但此法未經抽提除去雜質,故A260/A280比值低。同時由于核酸酶的存在及高溫環境下,DNA易降解,線粒體基因的擴增效率較低。堿裂解法是通過氫氧化鈉的裂解作用提取樣本基因組DNA,該方法用時短,但得到的DNAA260/A280比值與擴增效率均較低。離心柱法是在樣本中加入蛋白酶K酶解后,通過吸附柱的吸附、漂洗和洗脫等步驟,有效去除了雜質,得到的基因組DNAA260/A280比值較高,且能高效擴增出3個線粒體相關基因。說明通過離心柱法提取的PSCs基因組DNA更適于不同蟲株的分型鑒定。臨床AE患者手術樣本中幾乎無法獲得PSCs,但可獲得足量的囊壁病灶組織樣本。因此,本研究采用離心柱法來提取同一株系來源的PSCs和囊壁組織中的基因組DNA為模板進行擴增比較,發現該法提取的囊壁組織基因組DNAA260/A280比值偏低,僅擴增出elp基因,線粒體基因cob、nad2和cox1均未得到有效擴增,其原因可能與囊壁特有的組織結構有關。囊壁多由纖維增生、生發層及大量宿主來源的炎性細胞構成,生發層僅里有部分未成熟的PSCs[16-18],故使用囊壁組織提取基因組DNA擴增效率較低。同時,為排除宿主因素的干擾,本研究使用離心柱法提取了宿主(小鼠)組織的基因組DNA作為對照發現,未擴增出蟲體elp和線粒體基因cob、nad2和cox1,表明離心柱法提取的蟲體樣本基因組DNA擴增敏感度高、特異性強,無宿主來源細胞的污染。

綜上,本研究從提取的蟲體不同樣本中的基因組DNAA260/A280比值、濃度及線粒體相關基因擴增效果等方面綜合比較,得出采用離心柱法從多房棘球絳蟲的PSCs中提取的基因組DNAA260/A280比值和目的基因擴增效果最佳,更適宜于實驗室對多房棘球絳蟲不同蟲株基因型的有效鑒定研究。