減低劑量預處理單倍體外周血造血干細胞移植術后早期免疫重建的臨床研究

張友弟, 龐楠楠,2, 徐建麗, 王洪波, 陳 剛, 韓春霞, 江 明

(1新疆醫科大學第一附屬醫院血液病中心, 新疆維吾爾自治區血液病研究所, 烏魯木齊 830054;2中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所中國科學院生物醫學檢驗技術重點實驗室, 江蘇 蘇州 215163)

造血干細胞移植(HSCT)是治療血液系統惡性腫瘤最有效的方法之一,移植術后患者免疫功能的早期快速恢復是造血干細胞移植術成功的關鍵,不同的移植方案及移植術后的感染發生、免疫抑制劑的應用等因素均會對免疫細胞及免疫功能重建產生一定影響,在計劃移植之前要綜合考慮干細胞的來源及患者的一般情況(如年齡及是否合并有其他并發癥)等方面因素。由于部分患者一般情況較差,如年齡較大或合并有較嚴重的并發癥而不能接受常規的清髓性預處理方案,錯過了接受治療的可能。2013年起本課題組就開始探索我中心制定的減低劑量預處理高劑量非體外去T細胞輸注單倍體造血干細胞移植(Reduced intensity conditioning haploidentical high dose non-TCD in vitro peripheral blood stem cells transplantation, RIC-haplo-HDPSCT)模式,其特征有:預處理方案為FAB+ATG方案(氟達拉濱+阿糖胞苷+白消安+兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白);高劑量非體外去T細胞外周血造血干細胞輸注;在傳統的急性移植物抗宿主病(aGVHD)預防方案的基礎上,使用舒萊+激素的方案。前期臨床研究者[1-2]發現RIC方案適用于機體一般情況較差且年齡較大的患者,并且對這類患者臨床療效較好,課題組前期相關研究也發現該方案可獲得與常規移植預處理方案相當的臨床療效[3-4]。但是,在此方案下,不同免疫細胞在移植后早期的改變特征仍不明確。探討我中心制定的RIC-haplo-HDPSCT移植模式術后各免疫細胞變化特點及影響因素,是預防移植術后感染及復發的關鍵。本文初步研究從2013年1月-2022年8月用此模式移植的54例移植患者早期各免疫細胞亞群的表達情況,并且探討了aGVHD與各免疫細胞亞群變化的相關性,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取54例2013年1月-2022年8月在本中心行RIC-haplo-HDPSCT的患者為研究對象,其中男性25例,女性29例;年齡26～66歲;疾病類型:急性非淋巴細胞白血病(AML)26例,急性淋巴細胞白血病(ALL)11例,慢性粒細胞白血病(CML)5例,骨髓增生異常綜合征11例,急性NK細胞白血病(ANKL)1例。54例患者均成功植入,其中有34例患者移植術后未發生aGVHD,20例患者在移植術后 100 d內發生aGVHD,aGVHD分級:Ⅰ級10例,Ⅱ級6例,Ⅲ級2例,Ⅳ級2例。發生aGVHD的中位時間為39 d,54例患者外周血血象恢復時間為:中性粒細胞恢復天數為(18.5±4.8) d,血小板恢復天數為(18.6±6.7) d。同期在本院體檢中心進行健康體檢者20例作為對照組。本研究經過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準(倫理審批號:S210927-21),所有患者簽署知情同意書后進行。

1.2 移植預處理方案及干細胞采集、輸注FAB+ATG方案:即在移植之前的9～5 d給予每天靜脈注射30 mg/m2的氟達拉濱,阿糖胞苷(Ara-c)1～2 g/m2靜點;在移植之前的4～3 d靜點白消安(Bu)3.2 mg·kg-1·d-1;在移植前的4～1 d內,應用2.5 mg·kg-1·d-1的抗胸腺球蛋白靜脈注射。用北京泰爾茂比特optia分離機采集干細胞,采集當天輸注,54例患者單個核細胞(MNC)輸注中位數:14.7×108/kg;CD34+造血干細胞輸注中位數:7.9×106/kg;CD3+T細胞百分比輸注中位數:76%。

1.3 aGVHD的診斷及防治采用加強的GVHD預防方案,包括環孢素A、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和抗CD25單抗等,具體預防方案詳見本課題組前期研究[3-4]; aGVHD的明確診斷和分級依據西雅圖的診斷準則, aGVHD確診后, 首先選擇1～2 mg·kg-1·d-1的甲潑尼龍(MP),根據患者病情考慮是否聯合使用其他免疫抑制劑。

1.4 方法收集患者移植前、移植后30 d、60 d、90 d及對照組的外周血標本,分別抽取3～4 mL的新鮮抗凝血液標本(EDTA抗凝劑,綠頭抗凝管),用流式細胞儀(BD Canto Ⅱ)檢測各免疫細胞亞群(CD3、CD4、CD8、CD19、CD56)百分比,ELISA法檢測IgG、IgA、IgM細胞含量。

2 結果

2.1 移植術后未發生aGVHD患者早期各免疫細胞亞群動態變化在RIC-haplo-HDPSCT移植模式下,CD3+T細胞的數量在移植術后30 d時顯著降低,術后60 d時恢復至對照組水平;CD4+T細胞在移植術后30 d時顯著降低,30 d后緩慢恢復,但仍明顯低于對照組;CD8+T細胞在移植術后30 d時明顯降低,之后上升,在術后60 d時明顯高于對照組水平;CD19+B細胞在移植術后90 d內均明顯低于對照組,但呈緩慢上升趨勢;CD56+NK細胞移植術后30 d時顯著高于對照組,30 d后呈下降趨勢,但術后60 d及90 d與對照組無差異(圖1)。IgG在移植術后30 d升高,然后逐步下降,但與對照組相比,差異無統計學意義。移植術后早期IgA及IgM水平低于對照組,差異無統計學意義(圖2)。

注:與對照組比較, *P<0.05。

圖2 體液免疫IgA、IgG、IgM在移植術后早期的動態變化

2.2 移植術后早期發生與未發生aGVHD患者各免疫細胞表達情況的比較發生aGVHD患者CD8+T細胞及CD3+T細胞在移植術后30 d顯著高于未發生aGVHD患者(P<0.05),CD56+NK細胞在移植術后30 d顯著低于未發生aGVHD患者,發生與未發生aGVHD患者移植術后30 d、60 d、90 d CD4+T淋巴細胞、CD19+B淋巴細胞及體液免疫各細胞比較差異無統計學意義(圖3)。

注:與未發生aGVHD患者比較, *P<0.05。

3 討論

HSCT術后免疫系統的恢復非常復雜,受感染、GVHD等多方面因素影響。移植術后非特異性免疫系統恢復較快,而特異性免疫系統的恢復可能需要2年或以上的時間[5]。免疫細胞及功能的早期快速恢復可以增加移植物的抗白血病作用,降低移植后感染的可能性[6],不同方案移植后的免疫重建及影響因素是當前的一個熱點問題,我中心前期清髓性單倍體移植方案對移植術后CD4+T細胞亞群和相關細胞因子IFN-γ、IL-17和TGF-β等的變化特點進行了深入研究,結果表明移植術后監測各免疫細胞亞群重建情況及細胞因子的動態變化對aGVHD的早期發現及指導臨床治療有重要意義[7-8]。經過多年的臨床實踐,本中心制定了一套RIC-haplo-HDPSCT移植方案,該方案采用高劑量的外周造血干細胞輸注,并且采用加強的預防感染的特點,在早期的臨床試驗中,這種方法與同胞全相合具有類似的臨床效果[3-4],但該方案移植術后各免疫細胞亞群的重建特點尚不清晰,國內外RIC方案術后的免疫重建規律研究報道較少,本文重點對該方案術后各免疫細胞亞群變化特點進行初步研究。

NK細胞屬于機體非特異性免疫系統,是異基因造血干細胞移植術后最早重建的免疫細胞亞群,在早期介導對白血病細胞及病原體的免疫中發揮重要作用,在本研究中, CD56+NK細胞的比例在移植術后30 d左右迅速上升,且比值明顯高于對照組,這與相關文獻報道相似[9-10]。曹勛紅及Ullah等[9-10]對異基因造血干細胞移植術后NK細胞的重建規律做了綜述,發現無論是全相合、單倍體還是自體造血干細胞移植,移植術后最先恢復的免疫細胞均是NK細胞。NK細胞的重建來源于CD34+造血干細胞和骨髓前體細胞,然后遷移到外周血分化成熟,雖然NK細胞數量通常在一個月內恢復,但是獲得成熟的NK細胞表型和完整的功能可能需要6個月或更長時間。

在本研究中,該移植模式下CD3+T淋巴細胞在移植術后60 d可達對照組水平,其中以CD8+T細胞恢復為主,而CD4+T細胞在移植術后恢復較為緩慢。在相關報道中表明不論移植物來源是骨髓、外周、還是臍帶血,術后T細胞的免疫功能重建都需要1～2年,甚至更久[11-12],而CD8+T細胞的重建在早期較快。研究表明[13]在早期T細胞的恢復主要是移植物中過繼轉移的記憶T細胞的擴張,而大多數擴張的T細胞為CD8+T細胞,這可能是與CD4+T細胞相比,CD8+T細胞在淋巴細胞減少的環境中更傾向于擴張。T淋巴細胞的免疫重建在移植后有兩種途徑:一是胸腺依賴途徑,二是非胸腺依賴途徑。在移植之前,患者接受了不用程度的化學治療,導致了對胸腺功能的損害,從而影響胸腺依賴途徑T細胞的增殖,而CD8+T細胞增殖可不完全依賴胸腺功能,CD4+T細胞卻依賴胸腺[14]。故而CD4+T細胞與CD8+T細胞兩者的恢復速度不同,并且出現移植后長期CD4/CD8比值倒置現象。

在此移植模式下,移植術后100 d內CD19+B淋巴細胞的比值均較低;B細胞的修復主要是初始B細胞和記憶B細胞的修復,而記憶B細胞的恢復是在CD4+T細胞的輔助下進行的。受多方面因素影響,B細胞的免疫重建需要1～2年時間[15]。本研究中發現IgG在移植術后30 d內較高,這可能與預防感染早期給予患者靜點丙種球蛋白有關,移植術后100 d內IgM、IgA與對照組相比無明顯差異。

本研究還發現發生aGVHD的患者CD8+T細胞在移植術后30 d顯著增高,與未發生aGVHD患者相比差異有統計學意義(P<0.05)。這表明CD8+T細胞數量的增多,可能預示著aGVHD的發生,有文獻[16-17]提示CD8+T細胞是引起aGVHD的重要效應細胞,本研究中還發現發生aGVHD的患者CD56+NK細胞在移植術后30 d明顯低于未發生aGVHD患者,表明CD56+NK細胞的延遲恢復可能與aGVHD的發生有關,宋娜[18]及Bunting等[19]研究也發現發生aGVHD患者移植術后30 d、60 d NK細胞絕對值計數均低于未發生aGVHD患者,且低水平的NK細胞計數預示著更高的重度aGVHD發生率和aGVHD總發生率。NK細胞重建與GVHD的關系一直存在爭議,研究發現[20-21]NKG2A+NK細胞抑制了T細胞的增殖和活化,這表明NKG2A+NK細胞數量的減少可能是GVHD的原因,而不是結果。

綜上,在RIC-haplo-HDPSCT移植模式下,移植術后早期免疫重建以CD56+NK細胞及CD8+T淋巴細胞為主,且CD8+T細胞高表達及CD56+NK細胞的延遲恢復可能與aGVHD 的發生有關,因在本研究中樣本數量不多,觀察時間較短,需要在今后增加樣本數量,并增加對免疫細胞功能的檢測以探討其在不同情況下的免疫細胞和功能的變化,以及免疫功能的恢復與感染、GVHD和復發之間的相關性,為臨床移植后免疫干預提供指導。