外周血IL-27、IL-35與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)mRNA在活動(dòng)性肺結(jié)核中的表達(dá)水平及預(yù)測(cè)價(jià)值研究

馬雨婕, 王 晶, 李 穎, 加孜那·托哈依

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 烏魯木齊 830054; 2海南醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科, 海口 570100;3省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830054)

全球結(jié)核病負(fù)擔(dān)仍然沉重,對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的快速診斷和預(yù)防不容忽視[1]。巨噬細(xì)胞是抗結(jié)核感染最主要的細(xì)胞之一,其兩種(M1/M2型)極化狀態(tài)可通過(guò)調(diào)節(jié)促炎或抗炎信號(hào)的表達(dá)來(lái)控制病理,導(dǎo)致感染的不同結(jié)局[2]。結(jié)核中巨噬細(xì)胞M1極化伴隨高水平的γ-干擾素(IFN-γ)、C-X-C基序配體(CXCL10與CXCL11)等分泌,M2極化伴隨高水平的白介素10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等分泌[3-4]。研究表明外周血血漿中IFN-γ、IL-10、趨化因子CXCL10、CXCL11對(duì)診斷活動(dòng)性肺結(jié)核具有價(jià)值[5-6],血漿TGF-β的變化與肺結(jié)核的肺損傷有關(guān)[7]。IL-12家族因子在結(jié)核中參與巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)。研究表明IL-12家族成員IL-27與IL-35在肺結(jié)核外周血血漿中的表達(dá)升高,被認(rèn)為是判斷結(jié)核的可能標(biāo)志物;IL-27、IL-35亞單位即P35亞基、EB病毒誘導(dǎo)基因3編碼蛋白(EBI3)的mRNA在活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞中表達(dá)增高,且與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)[8-9]。本文探究上述因子(IL-27、EBI3、P35、IFN-γ、CXCL10、CXCL11、IL-10和TGF-β)在活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血的mRNA表達(dá)并評(píng)估其預(yù)測(cè)價(jià)值,以探討其在結(jié)核免疫中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象以新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2020年3月-2021年12月入院且診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核的46例患者為病例組,選取同期于本院體檢的42例健康非肺結(jié)核人員為對(duì)照組。本研究已通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào): 20200320-142) ,取得納入對(duì)象知情同意。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)病例組按照2018年發(fā)布的《WS288-2017結(jié)核病診斷》診斷為結(jié)核病[10],根據(jù)病原學(xué)和影像學(xué)檢查結(jié)果診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核。診斷依據(jù)(存在以下情況一項(xiàng)及以上):(1)痰涂片或痰培養(yǎng)檢查中結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性;(2)影像學(xué)中有結(jié)核活動(dòng)性的肺部征象;(3)痰結(jié)核菌檢查陽(yáng)性后未治療或治療未達(dá)規(guī)定療程,仍有癥狀或檢查結(jié)果未改善。對(duì)照組為健康非結(jié)核的體檢人員且不符合結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。以上診斷由2位經(jīng)驗(yàn)醫(yī)師根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)綜合分析后各自做出。研究對(duì)象都同意保留血液樣本并進(jìn)行相關(guān)檢查。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)(1)伴有腫瘤、免疫性疾病(如敗血癥、菌血癥、病毒性肝炎、HIV感染等結(jié)核外感染、類(lèi)風(fēng)濕等),服用化療藥、激素或免疫抑制劑人員;(2)嚴(yán)重心、肝、腎功能不全或精神系統(tǒng)疾病患者;(3)處于妊娠或哺乳期;(4)無(wú)法獲得血樣和臨床資料的人員。

1.4 檢測(cè)方法分別收集兩組入選者的臨床資料,并收集清晨空腹時(shí)的外周靜脈血5 mL,全血離心(3 000 r/min,5 min) 后收集血清外剩余液體,加入紅細(xì)胞裂解液1 mL冰上置10 min。離心(3 000 r/min,5 min) 棄上清后用PBS 1 mL清洗1～2次,保留裂解后沉淀物。用Trizol試劑盒(北京全式金公司)提取細(xì)胞總RNA沉淀,用20～40 μL DEPC去離子水(北京酷來(lái)博科技有限公司)重懸在EP管中,在-80℃ 冰箱中保存以備后用。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司No.RR037A)逆轉(zhuǎn)錄具有合格純度和濃度的RNA為cDNA:將RNA調(diào)至500 ng/μL,根據(jù)說(shuō)明制備10 μL逆轉(zhuǎn)錄體系。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在37℃中15 min,后在85℃進(jìn)行5 s使逆轉(zhuǎn)錄酶失活,反應(yīng)在4℃下直至結(jié)束,cDNA可放在-20℃冰箱中保存。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司No.RR820A)制備相應(yīng)體系(含有1 μL cDNA,5 μL TB Green溶液,0.2 μL ROX染料,0.4 μL正向、反向引物和3 μL DEPC水以補(bǔ)足為10 μL體系)。將測(cè)定指標(biāo)的正向和反向引物(引物合成于上海生工生物工程公司,序列見(jiàn)表1)按比例加入體系,設(shè)置Q6熒光定量PCR儀為95℃預(yù)變性34 s,95℃反應(yīng)5 s,后于60℃退火30 s,并循環(huán)進(jìn)行40次PCR反應(yīng);收集熔解曲線和拷貝數(shù)(CT) 值,并采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對(duì)照組臨床資料比較病例組與對(duì)照組性別、年齡及體質(zhì)指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白水平高于對(duì)照組,血紅蛋白、白蛋白水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),見(jiàn)表2。

表2 病例組與對(duì)照組臨床資料比較

2.2 病例組與對(duì)照組外周血IL-27、EBI3、P35及巨噬細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)水平的比較病例組外周血中IL-27、EBI3、IFN-γ、CXCL10、CXCL11、IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);病例組和對(duì)照組P35的mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。

表3 病例組與對(duì)照組外周血IL-27、EBI3、P35及巨噬細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)水平的比較[M(P25, P75)]

2.3 受試者外周血中IL-27、EBI3、P35及巨噬細(xì)胞相關(guān)mRNA水平的相關(guān)性IL-27 mRNA水平與EBI3、CXCL10、CXCL11、IL-10的mRNA水平變化呈正相關(guān)(r=0.234、0.320、0.291、0.272,P<0.05); CXCL10 mRNA與CXCL11 mRNA水平變化呈正相關(guān)(r=0.260,P<0.05);IFN-γ mRNA與TGF-β mRNA水平變化呈正相關(guān)(r=0.315,P<0.01),見(jiàn)表4。

表4 受試者外周血中IL-27、EBI3、P35及巨噬細(xì)胞相關(guān)mRNA水平的相關(guān)性(r)

2.4 活動(dòng)性肺結(jié)核外周血IL-27、EBI3、P35及巨噬細(xì)胞相關(guān)mRNA的預(yù)測(cè)價(jià)值IL-27、CXCL11與IL-10的mRNA在ROC曲線下面積(AUC)分別為0.807、0.773、0.749 (P<0.001),均>0.7;其中IL-27 mRNA 的AUC值(0.807)、Youden指數(shù)(0.626)最高,其靈敏度(0.826)與特異度(0.800)均較高;P35 mRNA的AUC值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明IL-27、CXCL11和IL-10的mRNA水平升高對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核有較高預(yù)測(cè)價(jià)值,以IL-27 mRNA的預(yù)測(cè)價(jià)值更為突出,見(jiàn)表5、圖1。

圖1 外周血IL-27、EBI3、P35與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的mRNA水平預(yù)測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核的ROC曲線(a-c)

表5 外周血IL-27、EBI3、P35及巨噬細(xì)胞相關(guān)mRNA水平預(yù)測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核的ROC曲線結(jié)果

3 討論

結(jié)核的免疫結(jié)局與其病灶肉芽腫的形成發(fā)展?fàn)顟B(tài)密切相關(guān),免疫過(guò)程中受到多種細(xì)胞與細(xì)胞因子的作用調(diào)節(jié)。巨噬細(xì)胞的不同亞細(xì)胞型(M1與M2極化型)、與T細(xì)胞不同亞群如T輔助細(xì)胞(Th1、Th2)、調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞等被廣泛提及;IL-12家族因子在結(jié)核中參與介導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移、各T細(xì)胞亞群的分化與免疫反應(yīng)[11-12]。本研究重點(diǎn)關(guān)注IL-12家族因子IL-27、IL-35與巨噬細(xì)胞相關(guān)因子在活動(dòng)性肺結(jié)核中的mRNA表達(dá)與預(yù)測(cè)價(jià)值。

本研究中病例組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白水平高于對(duì)照組,血紅蛋白、白蛋白水平低于對(duì)照組,表明病例組存在明顯的炎性消耗與炎性微環(huán)境變化[13]。結(jié)核中巨噬細(xì)胞根據(jù)炎癥微環(huán)境變化可分化為不同亞細(xì)胞型,如M1型(經(jīng)典激活型)與M2型(選擇性激活型),兩者促進(jìn)不同細(xì)胞因子表達(dá)且導(dǎo)致不同感染狀態(tài)[2]。M1極化伴隨高水平的IFN-r、CXCL10、CXCL11等分泌,表現(xiàn)促炎表型特征,可有效抑制結(jié)核菌的感染擴(kuò)散;M2極化伴隨高水平IL-10、TGF-β等分泌,多體現(xiàn)抗炎與組織重塑作用。有研究表明肺結(jié)核患者在急性轉(zhuǎn)慢性感染時(shí)出現(xiàn)促炎與抗炎細(xì)胞因子譜的轉(zhuǎn)換,肺組織中有巨噬細(xì)胞兩種極化形式共存[14]。本研究病例組中M1極化相關(guān)的IFN-γ、CXCL10、CXCL11和 M2極化相關(guān)的IL-10與TGF-β的mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組,證實(shí)活動(dòng)性肺結(jié)核外周血同時(shí)存在M1和M2型極化因子的mRNA變化。

CXCL10與CXCL11均為巨噬細(xì)胞M1極化主要驅(qū)動(dòng)因子IFN-γ誘導(dǎo)的趨化因子[15],兩者被認(rèn)為介導(dǎo)免疫細(xì)胞的增加與募集,有利于建立巨噬細(xì)胞抗菌的微環(huán)境[6]。研究表明CXCL10在患有雙側(cè)或空腔疾病的肺結(jié)核個(gè)體中顯著升高且與細(xì)菌負(fù)荷呈正相關(guān),CXCL11的血清評(píng)價(jià)作用在活動(dòng)性肺結(jié)核中高于CXCL10,在結(jié)核性淋巴結(jié)炎中高于IFN-γ[3]。本研究中CXCL10與CXCL11的mRNA表達(dá)水平均在病例組中升高,兩者表達(dá)呈正相關(guān),CXCL11的mRNA表達(dá)水平預(yù)測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核的價(jià)值較高,進(jìn)一步表明外周血CXCL11的mRNA表達(dá)為預(yù)測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核的潛在生物標(biāo)志。

抑炎因子IL-10、TGF-β為公認(rèn)的巨噬細(xì)胞M2型極化因子[16],兩者下調(diào)Th1炎性反應(yīng),加速結(jié)核向明顯疾病發(fā)展。本研究結(jié)果顯示IL-10 mRNA表達(dá)水平預(yù)測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核的價(jià)值較高,表明外周血IL-10的mRNA表達(dá)為預(yù)測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核的潛在生物標(biāo)志, IL-10在結(jié)核中升高并呈較為穩(wěn)定的表達(dá)可能抑制了機(jī)體清除細(xì)菌的能力。

IL-27是IL-12家族細(xì)胞因子,由抗原呈遞細(xì)胞 (APCs) 經(jīng)Toll樣受體 (TLR) 活化產(chǎn)生。研究表明肺結(jié)核支氣管肺泡灌洗液中IL-27與趨化因子的濃度升高相關(guān)[17];此外IL-27還表現(xiàn)抗炎特性,抑炎因子IL-10在Th1細(xì)胞的表達(dá)被認(rèn)為依賴于IL-27[18]。研究顯示IL-27使細(xì)胞對(duì)TLR的反應(yīng)更為敏感,表明IL-27可能參與正反饋回路[19]。本研究中病例組IL-27 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組,且與促炎因子CXCL10、CXCL11 mRNA水平變化呈正相關(guān),與抗炎因子IL-10 mRNA表達(dá)呈正相關(guān),這符合既往IL-27在結(jié)核中的雙重免疫特點(diǎn),同時(shí)表明其變化與巨噬細(xì)胞極化因子變化有關(guān)聯(lián)。IL-27 mRNA的AUC值、Youden指數(shù)高于其他所測(cè)因子,表明外周血IL-27 mRNA預(yù)測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核的價(jià)值更高,可能與IL-27參與正反饋回路或在肺結(jié)核中更廣泛的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)有關(guān)。

IL-35與IL-27同屬I(mǎi)L-12家族,結(jié)構(gòu)上共享EBI3亞基,IL-35與IL-10、TGF-β共同調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞相關(guān)的免疫抑制。有研究表明EBI3和P35 mRNA在活動(dòng)性肺結(jié)核外周血與肺組織的單核細(xì)胞中升高,且與細(xì)菌負(fù)荷呈正相關(guān)[9];也有研究表明活動(dòng)性肺結(jié)核患者的血清IL-35相對(duì)于穩(wěn)定患者表達(dá)偏低,與肺結(jié)核病情程度呈負(fù)相關(guān)[20]。本研究病例組中EBI3 mRNA水平高于對(duì)照組,P35 mRNA水平稍高于對(duì)照組但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;P35 mRNA的AUC值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因可能與IL-27抑制Treg分化作用有關(guān),潛在導(dǎo)致IL-35的來(lái)源喪失[19]; IL-12家族因子對(duì)結(jié)核免疫調(diào)節(jié)作用具有復(fù)雜性,其在結(jié)核進(jìn)展中促炎或抑炎的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

綜上,本研究初步表明,活動(dòng)性肺結(jié)核外周血中巨噬細(xì)胞M1和M2極化相關(guān)mRNA水平均有變化,與IL-27 mRNA水平升高有相關(guān)性;其中IL-27、CXCL11和IL-10的mRNA水平升高對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核有預(yù)測(cè)價(jià)值,以IL-27 mRNA的預(yù)測(cè)價(jià)值更為突出。本研究的樣本量有限,且研究對(duì)象存在地區(qū)局限性,不排除因此導(dǎo)致的研究結(jié)果誤差;關(guān)于IL-12家族因子和巨噬細(xì)胞相關(guān)mRNA對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的雙重免疫調(diào)節(jié)效力與臨床價(jià)值需要多中心大樣本研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。