褪黑素通過激活Nrf2抑制鐵死亡改善隨意皮瓣存活

樓承浩，盧穎楓，王健

1.溫州醫科大學附屬第一醫院 創面修復科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 手外科·周圍神經外科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035

隨意皮瓣是骨外科、創面修復科重要的修復重建手段[1-2]。隨意皮瓣手術方式相對便捷，然而，隨意皮瓣的遠端容易發生缺血再灌注損傷，導致皮瓣組織壞死[3]。鐵死亡是一種特殊的細胞死亡模式，在導致缺血再灌注損傷影響組織存活起到一定作用[4]。目前對于抑制鐵死亡的可能分子機制有了一定的研究，核紅細胞因子2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）在減輕脂質過氧化抑制鐵死亡上起到了關鍵作用[5]。抑制Nrf2可能會導致脂質過氧化物（lipid hydroperoxide, LPO）的積累和促進鐵死亡相關的疾病發生[6]。褪黑素（melatonin, MLT）是一種由松果體分泌的激素，主要與調節人體晝夜節律相關，同時也具有極強的抗氧化能力和過氧化物自由基清除能力[7]。其不良反應少，安全性高，近年來大量研究表明MLT在免疫調節、抗衰老、保護心血管、抗腫瘤等多種疾病上都具有治療作用[8-9]。為了進一步探討MLT對皮瓣保護的機制，了解鐵死亡對皮瓣存活的影響，在小鼠上設計一系列實驗以探討MLT是否可以通過抑制鐵死亡從而減輕隨意皮瓣的缺血再灌注損傷，促進隨意皮瓣的存活。

1 材料和方法

1.1 材料成年雄性C57BL/6小鼠（18～20 g）由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2021-0020。麻醉后去除背部毛發。在小鼠背部設計1.5 cm×4.5 cm隨意皮瓣，將皮瓣鈍性分離。在皮瓣基部切斷雙側髂腰動脈4-0醫用縫線原位縫合。將小鼠隨機分組，首先取20只小鼠隨機分為對照組、MLT組。第二步聯合使用Nrf2抑制劑ml385，取45只小鼠隨機分為對照組、MLT組、MLT+ ml385組。自造模開始，對MLT組和MLT+ml385組小鼠腹腔內注射MLT 20 mg/kg，MLT+ml385組在給藥前30 min腹腔內注射Nrf2抑制劑ml38530 mg/kg。對照組注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續7 d。

1.2 小鼠術后皮瓣形態學觀察觀察皮瓣的顏色、質地、彈性等以判斷皮瓣存活情況。切取完整皮瓣組織，稱重并記錄為皮瓣濕重。烘箱中充分烘干記為皮瓣干重。使用干濕重變化計算各組皮瓣組織含水量，評估皮瓣水腫情況。

1.3 激光多普勒血流灌注（laser Doppler blood flow，LDBF）成像麻醉后用脫毛膏脫去新生毛發，用激光多普勒儀對小鼠背部血流信號進行掃描。使用moor LDI Review軟件分析數據，評估皮瓣血流量及灌注強度。

1.4 免疫組織化學染色將皮瓣組織切片烘干脫蠟水化。使用兔二步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）染色。實驗中所用一抗：caspase-3 （1:100）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2, SOD2）（1:100）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）（1:100）、CD34（1:100），梯度脫水后中性樹膠封片。

1.5 組織HE及Masson染色染色前將切片脫蠟水化。按HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）及Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書步驟染色。梯度乙醇及二甲苯脫水后中性樹膠封片。

1.6 皮瓣組織丙二醛（malonaldehyde,MDA）、脂質過氧化物（lipid peroxide,LPO）、組織鐵（tissue iron,Fe）含量檢測及谷胱甘肽（glutathione,GSH）檢測使用提取試劑將各組小鼠中段皮瓣組織低溫勻漿后離心取上清液用于后續檢測。按說明書分別使用MDA檢測試劑盒、LPO測試盒及組織Fe測定試劑盒、GSH檢測試劑盒檢測各組組織提取液中各種含量。

1.7 透射電子顯微鏡麻醉后迅速割取約0.5 mm× 1 mm×1 mm大的全層皮瓣組織塊，2.5%戊二醛固定。1%鋨酸后固定，醋酸鈾溶液室溫染色1 h。梯度丙酮脫水，放入包埋液包埋后在65 ℃烘箱聚合1～ 2 d。用玻璃刀切半薄切片，染色觀察定位后，進行超薄切片，染色烘干后進行電鏡觀察。

1.8 蛋白質印跡（Western blot）檢測提取各組皮瓣組織蛋白，經凝膠電泳、電轉移和緩沖液封閉后用TBST清洗后，將膜浸潤至一抗稀釋液稀釋的目標蛋白一抗中，4 ℃搖床上孵育過夜。實驗中所用一抗：Nrf2（1:1000），鐵結合蛋白輕鏈（ferritin light chain, FTL）（1:1000），血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）（1:1000），谷胱甘肽過氧化酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）（1:1000）。TBST洗去一抗，并將膜浸潤至用TBST稀釋的與種屬對應的二抗中，室溫慢搖床孵育1.5 h。將曝光液均勻滴至PVDF膜表面，使用化學發光顯像儀成像。

1.9 統計學處理方法采用GraphPad Prism 8.4.2統計學軟件對數據進行統計學分析。計量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采取LSD-t檢驗法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MLT促進小鼠隨意皮瓣存活術后第3天，對照組小鼠隨意皮瓣出現大面積淤斑，MLT組僅隨意皮瓣遠端散在分布部分淤點。術后第7天，對照組淤斑連接成片，組織發黑、干燥、皺縮變硬，壞死面積趨于穩定，而MLT組僅隨意皮瓣遠端存在少量壞死組織，在第3、第7天MLT組相比于對照組存活面積增加（均P＜0.05），見圖1A-D。LDBF成像評估，MLT組較對照組小鼠皮瓣血流信號強度增高（均P＜0.05），富血流面積較大，其近端及周邊可見少量新生血管進入皮瓣內，見圖1E、圖1F。對照組遠端皮瓣明顯水腫，而MLT組水腫程度較低，MLT組組織含水量較對照組減少（均P＜0.05），見圖1G、圖1H。HE及Masson染色結果顯示，對照組小鼠皮瓣組織中膠原纖維排列不規則、疏松，小血管較少，MLT組膠原纖維排列密集有序，小血管數量多，見圖1I、圖1J。

圖1 MLT促進小鼠隨意皮瓣存活

2.2 MLT提高隨意皮瓣的抗氧化能力并抑制鐵死亡MLT組皮瓣中凋亡指標caspase-3的含量較對照組降低（P＜0.05），見圖2A、圖2B。MLT組CD34陽性小血管含量明顯高于對照組，并且VEGF表達增加（P＜0.05），見圖2C-F。MLT組抗氧化蛋白SOD2表達較對照組上調（P＜0.05），見圖2G、圖2H。MLT組MDA和LPO含量均較對照組降低（P＜0.05），見圖2I、圖2J。MLT組皮瓣中的組織Fe含量較對照組降低（P＜0.05），見圖2K。MLT組較對照組增加了皮瓣組織中GSH含量（P＜0.05），見圖2L。與對照組比MLT組Nrf2表達增加（P＜0.05），抗氧化蛋白HO-1的表達上調（P＜0.05），Fe轉運蛋白SLC40A1的表達上調（P＜0.05），鐵死亡的關鍵抑制酶GPX4含量增加（P＜0.05），見圖2M-Q。2組小鼠皮瓣的缺血損傷區域發現線粒體膜密度增加，體積縮小，細胞核大小基本正常，但染色質減少，核仁缺失，符合鐵死亡損傷的特征，見圖2R。

圖2 MLT提高隨意皮瓣的抗氧化能力并抑制鐵死亡

2.3 抑制Nrf2 拮抗MLT對小鼠隨意皮瓣存活的保護作用與MLT組比，MLT+ml385組Nrf2下調（P＜0.05）、抗氧化指標HO-1下調（P＜0.05）、抗脂質過氧化指標GPX4下調（P＜0.05）、FTL下調（P＜0.05），見圖3。

圖3 抑制Nrf2逆轉MLT減輕鐵死亡的作用

3 討論

隨意皮瓣在設計時不涉及主要血供血管，僅通過蒂部毛細血管網及基底部滲血提供血運，在較長的隨意皮瓣血運得到重建前皮瓣遠端往往會由于血液灌注不足導致缺血損傷。MLT已被證明具有廣泛的生物學特性，除了調節生物節律的作用，在抗凋亡、抗炎、抗氧化方面的作用被廣泛研究[10-11]。本研究首先驗證了MLT對小鼠隨意皮瓣的存活具有保護作用，在組織形態學上表現為MLT增加了小鼠隨意皮瓣第3天及第7天的存活面積，一定程度上恢復了隨意皮瓣在第7天的血流灌注，促進了小血管生成和皮瓣組織結構的穩定，在病理生理上MLT通過促進小血管的再生，緩解了皮瓣組織中凋亡的發生，提升了皮瓣的抗氧化能力。隨意皮瓣在缺血再灌注損傷后代謝失衡產生的過量活性氧（reactive oxygen species, ROS）被認為是導致皮瓣壞死的誘因之一。本研究結果證明MLT給藥后不但上調了抗氧化蛋白的表達，并且提升了抗氧化小分子GSH的含量，進而提高了皮瓣組織抗氧化的潛力。并且MLT組MDA含量降低，提示MLT減輕了脂質過氧化水平最終促進了皮瓣存活。

為了深入探究MLT促進隨意皮瓣存活的可能機制，通過掃描電鏡觀察到了隨意皮瓣的壞死中存在鐵死亡的發生，鐵死亡的本質是一種由Fe介導的脂質過氧化損傷。鐵死亡的主要機制，一方面是細胞內游離Fe離子異常積累，導致LPO的異常積累[12]；另一方面，GSH還原系統抗氧化能力代償不足，無法及時清除LPO導致細胞死亡[13]。Fe代謝、氧化應激、脂質過氧化和表觀遺傳調控的紊亂都與缺血再灌注損傷中鐵死亡的進展有關[14]。MLT在新生兒缺氧缺血性腦病模型中對鐵死亡的發生具有抑制作用[15]。MLT在小鼠腎小管上皮細胞中可以緩解急性腎損傷后發生的鐵死亡[16]。本研究MLT給藥后隨意皮瓣壞死區域的LPO水平降低、含量減少，說明MLT可能調節了不飽和磷脂和ROS之間的LPO反應。Western blot檢測結果及組織GSH含量檢測結果表明MLT給藥后通過保護GSH抗脂質過氧化還原系統抑制了鐵死亡。同時，對組織Fe含量測定及轉Fe蛋白SLC40A1表達的檢測提示MLT還促進了細胞內的游離Fe向細胞外轉運調節了隨意皮瓣中的Fe代謝。MLT可以通過抑制鐵死亡促進隨意皮瓣存活。

MLT 是抑制隨意皮瓣鐵死亡的潛在信號通路。目前研究發現的鐵死亡調節通路包括TP53、NFE2L2、YAP1/YAP和WWTR1/TAZ等[13]。其中Nrf2在抑制鐵死亡上具有多重調節作用。此前已有大量研究表明，MLT可以激動Nrf2發揮生物學功能，有研究發現MLT可以通過激活AKT/Nrf2通路抑制氧化應激，從而抑制公雞Leydig細胞的凋亡[17]。本研究發現MLT給藥后在皮瓣中Nrf2的表達水平顯著提升。因此，MLT對鐵死亡的抑制作用很可能是通過激活Nrf2而實現的。使用Nrf2的抑制劑ml385腹腔注射給藥以抑制皮瓣中Nrf2生物活性[18]。ml385導致了GSH合成降低、利用GSH進行抗脂質過氧化能力減弱、LPO含量增加、組織Fe代謝活性降低、組織Fe含量上升，從各方面說明了ml385可以阻斷MLT在皮瓣中對鐵死亡的抑制作用。這些結果也表明MLT對于隨意皮瓣鐵死亡的抑制作用依賴于激活Nrf2及其下游包括xCT/GSH/GPX4還原系統和Fe代謝相關的信號通路，Nrf2通過參與調控鐵死亡起到促進隨意皮瓣存活的作用，但對于MLT如何在隨意皮瓣中激活Nrf2仍需進一步探究。

本研究證明MLT可以促進小鼠隨意皮瓣存活。鐵死亡是影響隨意皮瓣存活的因素之一，抑制鐵死亡能夠促進隨意皮瓣存活；MLT可以通過激動Nrf2提高抗氧化能力，減輕脂質過氧化并促進Fe代謝抑制鐵死亡。但影響隨意皮瓣存活的因素眾多，機制復雜，仍需進一步深入的研究及探索。