骨質疏松患者Th17/Treg細胞平衡狀況及其與骨代謝指標的相關性

付海寧，丁曉明，李新宇，高博，陸雪穎，梁冠文

1.寶雞市婦幼保健院檢驗科，陜西 寶雞 721000；

2.寶雞市婦幼保健院內科，陜西 寶雞 721000；

3.寶雞市人民醫院骨二科，陜西 寶雞 721000

骨質疏松累及全身骨骼，其基本病理特征表現為骨量丟失、骨微結構變化、骨小梁坍塌，不僅會增加骨骼脆性，還會加大骨折發生風險[1]。相關文獻顯示，輔助性T 細胞17(T helper cell 17，Th17)會產生阻礙骨吸收細胞生長及激活的相關因子，從而在骨質疏松過程中發揮作用[2]。調節性T細胞(regulatory cell，Treg)能發揮免疫抑制作用，對骨質破壞進行抑制[3]。正常骨代謝指的是骨形成(成骨細胞介導)同骨吸收(破骨細胞介導)間的平衡過程，且在生理下破骨細胞與成骨細胞一起對正常骨轉化進行控制，進而保持骨穩態，骨代謝的不平衡就會引發骨疾病，于骨質疏松發展期間，骨代謝也發揮重要作用[4-5]。相關文獻顯示，在分化發育期間，Th17、Treg被諸多細胞因子調控，對機體免疫應答進行參與，經分化、激活成骨與破骨細胞對骨代謝進行干擾[6]。目前，Th17、Treg 細胞平衡于骨質疏松中的具體機制還不明確。基于此，本研究旨在探討Th17、Treg 細胞平衡在骨質疏松患者中的表達意義及其與骨代謝指標的關系，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019年3月至2022年2 月在寶雞市婦幼保健院診治的120 例骨質疏松患者(骨質疏松組)的臨床資料。納入標準：(1)同骨質疏松相關診斷標準[7]相符；(2)骨密度T 值不足2.5 SD；(3)年齡超過18歲；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)伴有腎、肝功能不全；(2)伴有類風濕、原發性甲亢、糖尿病等干擾骨代謝的疾病；(3)6 個月內使用過干擾骨代謝的藥物。另選擇同期在本院進行體檢的健康者100例作為對照組。骨質疏松組中男性51 例，女性69 例；年齡52～76 歲，平均(63.83±6.15)歲。對照組中男性42例，女性58 例；年齡54～78 歲，平均(64.14±6.33)歲。兩組受檢者性別和年齡比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 觀察指標與檢測方法 (1)Th17、Treg：Th17檢測：收集所有受檢者空腹狀態下4 mL 全血，選擇乙二胺四乙酸進行抗凝，并在60 min 內提取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，置入佛波醇乙酯、離子霉素、莫能霉素進行刺激，在二氧化碳(carbon dioxide，CO2)細胞培養箱培養4 h，之后置入藻紅蛋白-抗人CD8 mAb 及經異硫氰酸熒光素染色后的抗人CD3 mAb，固定液置入后破膜，再置入PERCP-CY5.5 抗人白介素-17A (interleukin-17A，IL-17A)及200 μL 固定液，上機檢測。Treg 檢測：收集所有受檢者空腹狀態下3 mL全血，選擇乙二胺四乙酸進行抗凝，并在60 min內提取PBMCs，避光后，置入藻紅蛋白-抗人CD8 mAb及經異硫氰酸熒光素染色后的抗人CD3 mAb，在CO2細胞培養箱培養1 h，將同定液置入，等待1 h，置入穿膜液，再等待1 h，置入PERCPCY5.5 抗人牛叉頭型基因P3 (Forkhead Box P3，FOXP3) FOXP3 后孵育2 h，將200 μL 固定液置入，上機檢測。(2)骨代謝炎性細胞因子指標：收集所有受檢者空腹狀態下5 mL肘靜脈血，以3 000 r/min的速度離心10 min，使用酶聯免疫吸附法檢測骨代謝炎性細胞因子指標[包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、轉 化 生 長 因 子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)]。(3)骨代謝蛋白酶活性指標：使用酶聯免疫吸附法檢測所有受檢者的骨代謝蛋白酶活性指標[包括基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、Ⅰ型膠原吡啶交聯終肽(collagenⅠcross-linked carboxy terminal telopeptide，ICTP)、Ⅰ型前膠原氨基端原肽(procollagen I of aminoterminal propeptide，PINP)]。

1.3 統計學方法 應用SPSS20.0 統計軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，采用Spearman 相關性分析Th17、Treg 與骨代謝指標的關系。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者的Th17、Treg水平比較 骨質疏松組患者的Th17水平明顯高于對照組，Treg水平明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的Th17、Treg水平比較(±s，%)Table 1 Comparison of Th17 and Treg levels between the two groups(±s,%)

表1 兩組受檢者的Th17、Treg水平比較(±s，%)Table 1 Comparison of Th17 and Treg levels between the two groups(±s,%)

組別骨質疏松組對照組t值P值例數120 100 Th17 2.30±0.41 1.43±0.35 16.978 0.001 Treg 3.18±0.78 4.47±0.63 13.568 0.001

2.2 兩組受檢者的骨代謝炎性細胞因子水平比較 骨質疏松組患者的TNF-α、IL-6 水平明顯高于對照組，IL-10、TGF-β水平明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組受檢者的骨代謝炎性細胞因子水平比較(±s)Table 2 Comparison of the levels of inflammatory cytokines in bone metabolism between the two groups(±s)

表2 兩組受檢者的骨代謝炎性細胞因子水平比較(±s)Table 2 Comparison of the levels of inflammatory cytokines in bone metabolism between the two groups(±s)

組別骨質疏松組對照組t值P值例數120 100 TNF-α(ng/mL)7.63±1.05 3.36±0.47 39.998 0.001ⅠL-6(pg/mL)33.60±5.35 20.34±3.28 22.539 0.001ⅠL-10(pg/mL)16.61±2.19 29.51±3.55 31.663 0.001 TGF-β(pg/mL)21.39±6.11 40.47±10.35 16.228 0.001

2.3 兩組受檢者的骨代謝蛋白酶活性指標比較 骨質疏松組患者的MMP-2、ICTP水平明顯高于對照組，PINP 水平明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 兩組受檢者的骨代謝蛋白酶活性指標比較(±s，ng/mL)Table 3 Comparison onthelevels ofbonemetabolicprotease activity indexesbetweenthetwo groups(±s,ng/mL)

表3 兩組受檢者的骨代謝蛋白酶活性指標比較(±s，ng/mL)Table 3 Comparison onthelevels ofbonemetabolicprotease activity indexesbetweenthetwo groups(±s,ng/mL)

組別骨質疏松組對照組t值P值120 100 912.36±109.82 648.59±75.28 21.040 0.001 6.50±0.84 4.02±0.56 26.118 0.001 0.85±0.13 1.44±0.20 25.370 0.001例數MMP-2ⅠCTP PⅠNP

2.4 Th17、Treg與骨代謝指標的相關性 經Spearman分析結果顯示，Th17 與TNF-α、MMP-2、ICTP 呈正相關(P＜0.05)，Treg 與TNF-α、MMP-2、ICTP 呈負相關(P＜0.05)，與TGF-β呈正相關(P＜0.05)，見表4。會促進人核因子KB受體活化因子配體(human nuclear factor KB receptor activator Ligand，RANKL)分泌及破骨細胞活化，從而使破骨細胞中的蛋白酶水平增加，介導骨降解過程[11]。相關文獻顯示，骨質疏松患者的Th17呈現出過度活化的狀態，然而其對蛋白酶活性及炎性反應的干擾機制還不明確[12]。有文獻顯示，Treg細胞經負反饋對破骨細胞的分化、形成進行抑制，在骨代謝平衡中發揮關鍵作用[13]。Treg細胞通過其重要轉錄因子Foxp3 經分泌IL-10、TGF-β 等細胞因子發揮調節免疫機制的作用，進而參與破骨抑制，降低骨吸收量[14]。本研究顯示，骨質疏松患者的Th17水平明顯高于健康體檢者，Treg水平明顯低于健康體檢者，差異均有統計學意義(P＜0.05)，提示骨質疏松患者可能出現Th17/Treg 平衡失衡。骨質疏松患者Th17 水平提升、Treg水平降低，可能是因為Th17能夠加快炎性細胞大量分泌RANKL，而RANKL又能夠在破骨細胞前發揮作用，進而對破骨分化進行誘導。

表4 Th17、Treg與骨代謝指標的相關性Table 4 Correlation analysis of Th17, Treg and bone metabolism indexes

本研究還顯示，參與骨代謝的相關炎性細胞因子，像TNF-α、IL-6水平明顯升高，IL-10、TGF-β水平明顯降低，TNF-α、IL-6能夠誘導初始T細胞分化為Th17細胞，進而分泌大量IL-17，最終形成鏈式效應，進一步加重骨質疏松，IL-10、TGF-β降低主要是由于Treg水平的降低導致其分泌的IL-10、TGF-β對應減少。且本研究經Spearman分析顯示，Th17同TNF-α呈正相關，Treg同TNF-α呈負相關，同TGF-β呈正相關。

MMP-2 屬于基質金屬蛋白酶中Ⅰ型膠原介導水解的一種重要催化酶，在骨骼Ⅰ型膠原的降解及合成過程中會出現諸多不良產物，PINP為Ⅰ型膠原前體發生裂解、產生成熟Ⅰ型膠原期間的產物，可反映膠原合成活力，ICTP屬于型膠原水解期間脫落羧基末端的產物之一，可反映膠原降解活力[15-16]。本研究顯示，骨質疏松患者的MMP-2、ICTP 水平明顯高于健康體檢者，PINP 水平明顯低于健康體檢者，差異均有統計學

3 討論

骨質疏松屬于骨病綜合征之一，它以骨微結構破壞、骨量降低為病理學典型表現，臨床中呈現為骨強度衰退、骨脆性提升等，會增加人體低能量性骨折的發生率[8]。在宏觀層面上，臨床特征表現為個子變矮、駝背、渾身疼痛等腰椎變形，嚴重者還會引發骨折、殘疾，甚至是死亡[9]。骨質疏松發病期間，會過度激活炎性反應及增加蛋白酶活性，這會直接影響骨代謝期間的骨吸收與形成，目前，調控蛋白酶活性及炎性反應的機制還尚未明確[10]。

Th17屬于人體中比較重要的一種CD4+T 細胞亞群，于維甲酸相關孤核受體γt(retinoid-relatedorphanreceptorgammat，RORγt)轉錄因子的介導作用下分化、成熟，同時會分泌大量IL-17。IL-17促炎活性極強，可以使炎性反應激活，同時干擾骨代謝，除此之外，IL-17還意義(P＜0.05)。提示于骨質疏松發病期間，蛋白酶活性明顯增加，膠原合成產物減少、裂解產物增多。基于此，經Spearman 分析顯示，Th17 同MMP-2、ICTP 為正相關關系，Treg同MMP-2、ICTP為負相關關系，提示骨質疏松發病期間，Th17的活化過度可使蛋白酶活性增強，進而加快骨基質中的膠原降解，Treg的降低會提升膠原降解活力。

綜上所述，骨質疏松患者的Th17 水平提升，Treg表達水平降低，它們共同干擾骨代謝期間的炎性反應與蛋白酶活性。