老年結腸癌合并2型糖尿病及結腸腺瘤RAGE、VEGF、TGF-β1的表達水平與生存狀況的相關性

曹竣植，童敏思，祝毛玲，王保才，史惠惠，臧意，馬靜，李力

同濟大學附屬楊浦醫院(上海市楊浦區中心醫院)消化科，上海 200090

結腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，流行病學調查顯示其病死率、發病率逐年增高、居高不下，且呈現逐漸年輕化趨勢[1]。近年來有研究證實，結腸癌與糖尿病之間存在密切聯系，糖尿病在發病率、預后方面均對結腸癌具有重要影響[2]。但目前關于糖尿病，尤其是2型糖尿病導致結腸癌發病率升高的作用機制尚未明確，一般認為與機體高血糖狀態引發機體氧化應激反應有關[3]。2 型糖尿病患者體內晚期糖基化終末產物受體(RAGE)在機體高血糖狀態引發機體氧化應激反應中功不可沒，不僅刺激產生氧自由基，還促進多種細胞因子如轉化生長因子β1蛋白(TGF-β1)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)大量釋放，因此在腫瘤細胞中多呈高表達[4]。為進一步探究機體高血糖狀態與氧化應激反應之間的關系，本文將檢測老年結腸腫瘤患者的RAGE、VEGF、TGF-β1表達水平，以探究其與臨床指標的關系以及對生存期的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年5 月至2020 年5 月同濟大學附屬楊浦醫院收治的100例老年結腸腫瘤患者進行研究。納入標準：(1)結腸鏡、手術取標本后經病理檢查確診為結腸癌者；(2)符合世界衛生組織(WHO)[5]關于糖尿病的相關診斷標準者；(3)納入研究前3個月未接受過化療、放療、靶向治療者；(4)納入研究前3個月無腸道術史者；(5)對本研究知情同意并簽署相關同意書者。排除標準：(1)合并妊娠期、1型糖尿病或因內分泌導致的糖尿病者；(2)合并免疫系統嚴重疾病者；(3)合并嚴重肝、心、腎疾病者。所有患者按照疾病類型分為結腸癌合并2 型糖尿病組(n=32)、結腸癌組(n=33)及結腸腺瘤組(n=35)。三組患者的臨床病理分期、腫瘤部位、浸潤深度比較差異均無統計學意義(P＜0.05)，具有可比性，見表1。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

表1 三組患者的一般資料比較[±s，例(%)]Table 1 Comparison of general data of patients among three groups[±s,n(%)]

表1 三組患者的一般資料比較[±s，例(%)]Table 1 Comparison of general data of patients among three groups[±s,n(%)]

指標年齡(歲)男/女臨床病例分期A期B期C期D期浸潤深度全層肌層黏膜腫瘤部位脾曲部降結腸橫結腸回盲部升結腸肝曲部乙狀結腸結腸癌組(n=33)71.79±3.02 21(63.64)/12(36.36)2(6.06)26(78.79)3(9.09)2(6.06)23(69.70)8(24.24)2(6.06)1(3.03)3(9.09)3(9.09)4(12.12)7(21.21)7(21.21)8(24.24)結腸腺瘤組(n=35)72.25±3.30 24(68.57)/11(31.43)2(5.71)25(71.43)5(14.29)3(8.57)26(74.29)6(17.14)3(8.57)2(5.71)3(8.57)4(11.43)5(14.29)5(14.29)7(20.00)9(25.71)結腸癌合并2型糖尿病組(n=32)72.19±3.18 22(68.75)/10(31.25)1(3.13)25(78.13)4(12.50)2(6.25)24(75.00)6(18.75)2(6.25)1(3.13)3(9.38)2(6.25)5(15.63)6(18.75)7(21.88)8(25.00)F/Z/χ2值0.256 0.252 1.067 0.730 1.564 P值0.880 0.882 0.983 0.948 0.999

1.2 方法

1.2.1 所用試劑 鼠抗人VEGF 單克隆抗體，購自福州邁新公司；兔抗人TGF-β1多克隆抗體、兔抗人RAGE 多克隆抗體及全套免疫組化試劑，購自武漢博士德公司。

1.2.2 檢測方法 所有患者采集腫瘤病灶組織及病灶周圍組織制作標本，對病理切片行常規脫蠟后入水，應用0.3%的H2O2對內源性過氧化物酶進行阻斷，封閉切片應用10%小牛血清，滴加1∶200稀釋的一抗，置于4℃環境24 h；次日1 h復溫，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)水洗后滴加1∶200的二抗，顯色應用二氨基聯苯胺(DAB)，完成顯色后于顯微鏡下進行觀察，梯度酒精行脫水，胞核行蘇木精復染，二甲苯透明，樹膠封片。陰性對照為PBS替代一抗，武漢博士德公司提供陽性對照。

1.2.3 分析方法 各目的抗原在腫瘤組織中的表達情況應用半定量法定量分析。在高倍顯微鏡(×500)下隨機選擇5個視野也即500個細胞，計算陽性細胞比例。0 分：陽性細胞數在5%以下；1 分：陽性細胞數在5%～24%；2 分：陽性細胞數在25%～50%；3分：陽性細胞數在51%～74%；4 分：陽性細胞數在75%以上。觀察切片中陽性細胞著色情況及強度：0 分，無色；1分，淡黃的；2分，棕黃色；3分，棕褐色。最終表達情況以比例和著色強度計分相加，0分：陰性(-)；1～2分：弱陽性(+)；3～5分：中等陽性(++)；6～7分：強陽性(+++)。

1.3 隨訪 通過電話、QQ、微信、電子郵件、信件等方式隨訪以掌握患者的病情、預后情況，隨訪時間間隔為3個月。隨訪截至時間為2022年5月。

1.4 觀察指標 比較結腸癌病理組織標本中RAGE、VEGF、TGF-β1表達情況；分析RAGE、VEGF、TGF-β1表達與年齡、腫瘤直徑、遠處轉移的關系；分析RAGE、VEGF、TGF-β1表達與生存期的相關性，其中生存期分為無復發生存期(RFS)：期間腫瘤無復發、轉移；總生存期(OS)：期間患者無死亡。

1.5 統計學方法 應用SPSS19.0 軟件進行數據統計學分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，采用單因素回歸分析RAGE、VEGF、TGF-β1與年齡、腫瘤直徑、遠處轉移的關系，采用Spearman 相關性分析法分析RAGE、VEGF、TGF-β1表達與生存期間的相關性。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌病理組織標本中RAGE、VEGF、TGF-β1表達情況 RAGE、VEGF、TGF-β1在結腸癌、結腸腺瘤以及結腸癌合并2 型糖尿病中均有表達(圖1～圖6)，且主要集中在癌癥細胞質內，主要位于固有腺上皮、癌旁黏膜上皮、癌細胞胞漿中；其中結腸癌合并2 型糖尿病組RAGE、VEGF、TGF-β1陽性高表達率明顯高于結腸癌組和結腸腺瘤組，且結腸癌合并2 型糖尿病組RAGE、VEGF、TGF-β1陽性表達率也明顯高于結腸癌組和結腸腺瘤組，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

圖1 RAGE在結腸癌中表達(×500)Figure 1 Expression of RAGE in colon cancer(×500)

圖2 RAGE在結腸腺瘤中表達(×500)Figure 2 Expression of RAGE in colon adenoma(×500)

圖3 RAGE在糖尿病合并結腸癌中表達(×500)Figure 3 Expression of RAGE in diabetes with colon cancer(×500)

圖4 VEGF在結腸癌中表達(×500)Figure 4 Expression of VEGF in colon cancer(×500)

圖5 VEGF在結腸腺瘤中表達(×500)Figure 5 Expression of VEGF in colon adenoma(×500)

圖6 VEGF在糖尿病合并結腸癌中表達(×500)Figure 6 Expression of VEGF in colon cancer combined with type 2 diabetes(×500)

表2 三組結腸癌病理組織標本中RAGE、VEGF、TGF-β1表達水平比較[例(%)]Table 2 Comparison of RAGE,VEGF,TGF-β1 in pathological tissue samples among the three groups[n(%)]

2.2 RAGE、VEGF、TGF-β1表達與臨床指標的關系 RAGE、VEGF、TGF-β1表達與年齡、腫瘤直徑無關(P＞0.05)；RAGE、VEGF、TGF-β1表達與結腸癌癌細胞組織遠處轉移有關(P＜0.05)，見表3。

表3 RAGE、VEGF、TGF-β1表達與臨床指標的關系[例(%)]Table 3 The relationship between the expression of RAGE,VEGF,TGF-β1 and clinical indicators[n(%)]

2.3 三組患者的RFS、OS 比較 三組患者的RFS、OS比較差異有統計學意義(P＜0.05)，且結腸癌合并2型糖尿病組RFS、OS均明顯短于結腸腺瘤組和結腸癌組，結腸腺瘤組明顯短于結腸癌組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 三組患者的RFS、OS比較(±s，d)Table 4 Comparison of RFS and OS among the three groups(±s,d)

表4 三組患者的RFS、OS比較(±s，d)Table 4 Comparison of RFS and OS among the three groups(±s,d)

注：與結腸癌組比較，aP＜0.05；與結腸腺瘤組比較，bP＜0.05。Note: Compared with colon cancer group,aP＜0.05; Compared with the colon adenoma group,bP＜0.05.

組別結腸癌組結腸腺瘤組結腸癌合并2型糖尿病組t值P值OS 335.19±49.29 362.19±55.12a 303.15±35.17ab 6.299 0.043例數33 35 32 RFS 203.14±101.52 289.46±146.29a 181.04±93.09ab 7.607 0.022

2.4 RAGE、VEGF、TGF-β1表達與RFS、OS 的相關性 采用Spearman 相關性分析顯示，結腸癌患者RAGE、VEGF、TGF-β1表達與RFS、OS 呈負相關(P＜0.05)，見表5。

表5 RAGE、VEGF、TGF-β1表達與RFS、OS的相關性Table 5 Correlation between RAGE,VEGF,TGF-β1 expression and RFS,OS

3 討論

糖尿病是一種機體營養和代謝紊亂性疾病，發病機制與胰島素分泌不足有關，同時該病累及機體所有系統代謝，嚴重影響患者生存質量和生命健康。美國糖尿病學會和癌癥學會聯合發布的報告中指出，糖尿病在增加結腸癌、肝癌、子宮內膜癌患病方面具有積極作用[6]。根據相關流行病學調查也發現，我國糖尿病發病率和致死率與結腸癌的發病率與致死率具有一致性，加上糖尿病患者機體高糖特性對癌細胞具有快速復制的作用，復制后還能作為能量場幫助癌細胞遠處轉移，且葡萄糖轉化過程能引發正常細胞凋亡、壞死，進一步促進癌細胞遠處轉移[7]。

癌細胞在轉移過程中產生大量的晚期糖基化終產物，且該終產物不可逆，雖然其在正常人體內也會隨著年齡不斷增長，但因該終產物受體RAGE在人體器官淋巴細胞、組織、平滑肌細胞、內皮細胞內均廣泛存在，因此其水平在糖尿病患者機體內異常旺盛，與癌細胞結合可能產生相關生理、病理學改變，導致細胞壞死、損傷[8]。VEGF是一種高度特異性促血管生長因子，主要參與新血管生成和調控，與結腸癌形成具有一定相關性，同時參與腫瘤的轉移、侵襲[9]。TGF-β1則具有調解上皮細胞生長、調控腫瘤發生進展、調控細胞周期等作用，一般情況下惡性腫瘤均存在TGF-β信號通路異常情形[10]。

有研究結果表明，結腸癌合并2 型糖尿病患者機體內晚期糖基化終產物結合RAGE 后能激活細胞增殖、凋亡，刺激VEGF、TGF-β1過度表達；也能增強結腸癌、黑色素瘤、胰腺癌等癌細胞生成、轉移[11-12]。本研究中，通過對結腸腫瘤患者RAGE、VEGF、TGF-β1表達水平檢測發現，RAGE、VEGF、TGF-β1在單純結腸癌及結腸腺瘤中的表達水平明顯低于在結腸癌合并2 型糖尿病中的表達水平，這與上述研究結果基本一致，且分析原因發現RAGE、VEGF、TGF-β1的高表達可能與2型糖尿病患者結腸癌發病率更高有一定相關性，且與腫瘤TNM 分期、癌組織分化程度、淋巴結轉移等也具有一定相關性[13]。同時，本研究結果顯示，RAGE、VEGF、TGF-β1表達與腫瘤直徑、年齡無關，與結腸癌癌細胞組織遠處轉移有關，高表達RAGE、VEGF、TGF-β1的患者較低表達患者更易發生遠處轉移，這可能是因為高表達RAGE、VEGF、TGF-β1可有效抑制血管內皮細胞凋亡，降低內分泌治療及化療的效果，最終發生遠處轉移。

此外，通過觀察不同腫瘤患者RFS、OS發現，結腸癌合并2型糖尿病患者RFS、OS明顯短于結腸腺瘤組和結腸癌組，結腸腺瘤患者明顯短于結腸癌患者；進一步研究結果顯示，結腸癌患者RAGE、VEGF、TGFβ1表達與RFS、OS 呈負相關，表明高表達RAGE、VEGF、TGF-β1的患者生存期更短。原因可能是高表達RAGE、VEGF、TGF-β1在腫瘤細胞生長過程中能抑制細胞生長因子、周期蛋白活性，從而促進腫瘤增殖，同時促進血管生成，加速腫瘤細胞進一步演變，最終導致腫瘤細胞快速生成并轉移[14-15]。

綜上，RAGE、VEGF、TGF-β1在結腸癌組織中均有表達，其與患者生存期呈負相關，因此可將其作為診斷結腸癌、判斷預后的重要指標。