沉默Fcgr3降低SiO2誘導的小鼠肺泡巨噬細胞系MH-S炎性因子表達

李曉娜，齊先梅，張田甜，王 婧

中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 病理生理學系，北京 100005

硅沉著病是由長期吸入大量有害粉塵引起的以彌漫性肺纖維化為特征的疾病。硅沉著病造成肺功能低下、炎性反應、最終導致呼吸衰竭[1-2]。目前缺乏有效的治療藥物,因此探究硅沉著病的治療靶點已迫在眉睫。SiO2通過呼吸道進入肺泡,肺泡巨噬細胞吞噬SiO2,最終導致大量炎性因子被釋放,主要為腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6),促進纖維化[1,3]。FcγRⅢ是Fcgr3基因編碼的一種膜蛋白,是免疫球蛋白G的受體之一,具有增強攝取、吞噬融合、激活免疫和調節細胞因子的生理功能。在巨噬細胞中,FcγRⅢ對大腸桿菌的吞噬起到了關鍵的作用,由此影響機體炎性水平[4]。目前,Fcgr3在SiO2吞噬過程中的作用仍未見報道,探究參與吞噬SiO2的受體將有利于新的治療靶點的發現。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人胚腎細胞系293T(實驗室保存),小鼠肺泡巨噬細胞系MH-S(普諾賽公司)。

1.1.2 試劑:質粒pLKO.1(實驗室保存),Opti-MEM 培養基和胎牛血清(Gibco公司),Lipofactamine 2000和FcγRⅢ抗體(Invitrogen公司),高糖DMEM培養基和青鏈霉素(索萊寶公司),MH-S細胞專用培養基(普諾賽公司),ELISA試劑盒(R&D公司),反轉錄試劑盒(天根公司),晶體SiO2(Forsman Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒沉默質粒的構建:選擇用于shRNA表達的慢病毒載體pLKO.1-shRNA,其圖譜如下(圖1):pLKO.1-shNC為陰性對照質粒,psPAX2和pMD2.G為包裝質粒。

圖1 pLKO.1-shRNA質粒圖Fig 1 Map of pLKO.1 containing a shRNA insert

表1 Fcgr3 shRNA序列Table 1 Sequence of Fcgr3 shRNA

1.2.2 慢病毒的包裝:將細胞分為4組:對照組(pLKO-shNCshRNA)與FcγRⅢ沉默組(pLKO-Fcgr3shRNA1、pLKO-Fcgr3shRNA2、pLKO-Fcgr3shRNA3)。在FcγRⅢ沉默組中,將pLKO-Fcgr3shRNA1/pLKO-Fcgr3shRNA2/pLKO-Fcgr3shRNA3、psPAX2、pMD2.G各10 μg加入1.5 mL培養基opti-MEM中,同時將25 μL Lipofactamine 2000加入到1.5 mL培養基opti-MEM中,分別室溫孵育5 min后,將質粒混合液與Lipofactamine 2000混合液混勻,室溫孵育20 min?！?br>