丙泊酚減輕肺炎支原體感染所致肺損傷的機制探究

彭承旭 楊坤渹 向紅 吳君如

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)是與兒童急性呼吸道感染相關的主要病原體之一[1]。多數MP肺炎(MP pneumonia,MPP)患者通過大環內酯類或四環素治療后會康復;然而,由于抗生素不斷使用誘發了MP耐藥菌株的出現,進而導致臨床難治性MPP的逐年增加[2-3]。因此,尋找治療MPP的有效方法尤為重要。丙泊酚是一種快速、短效的靜脈麻醉藥,廣泛用于術后及ICU患者[4]。有研究證實,丙泊酚在不同程度的肺損傷過程中均發揮保護作用[5]。但關于丙泊酚對MP感染引起的肺損傷的潛在保護作用知之甚少。PI3K/Akt信號通路廣泛參與多個生物學過程[6]。丙泊酚已被證實可通過激活PI3K/Akt信號通路在缺血再灌注引發的腸和肺損傷中發揮保護作用[7]。綜上,猜想丙泊酚可能通過激活PI3K/Akt信號通路對MP感染所致的肺損傷具有保護作用。

資料與方法

一、材料

雄性SD大鼠,年齡6～8周齡,體質量為(200～230)g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,SCXK(京)2021-0011;MP(15531)獲自美國ATCC;PPLO肉湯培養基(GD-P0094846)、大鼠MP-IgM ELISA試劑盒(GD-E015278667)、大鼠CRP ELISA(GD-E018275651)試劑盒獲自上海GuanDao;丙泊酚(純度:99.52%,HY-B0649)、阿奇霉素(純度:98.0%,HY-17506)、渥曼青霉素(PI3K抑制劑,純度:99.85%,HY-10197)獲自美國MedChemExpress;大鼠IL-6 ELISA試劑盒(ER0042)、大鼠IL-18 ELISA試劑盒(ER0036)和大鼠TNF-α ELISA試劑盒(ER1393)均購自武漢FineTest。HE染色試劑盒(G1120)、Diff-Quik全血染色試劑盒(G1541)、TUNEL凋亡檢測試劑盒(T2190)和RIPA裂解液(R0020)獲自北京Solarbio;一抗p-PI3K(ab278545)、PI3K(ab191606)、p-Akt(ab38449)、Akt(ab8805)和β-actin(ab8226)均獲自英國Abcam。

二、方法

1 MPP模型構建及分組

MP溶解在PPLO肉湯培養基中,在37℃下孵育。對數生長期的MP通過顏色變化單位(color change unit,CCU)進行量化,使用含有10%胎牛血清的DMEM培養基調整至所需濃度。

將SD大鼠飼養在21℃,55%濕度和12 h光/暗循環下,自由獲取食物和水。將大鼠分為以下5組(n=12/組):對照組、MPP模型組、丙泊酚組、阿奇霉素組和丙泊酚+PI3K抑制劑(渥曼青霉素)組。為了誘導MP感染,通過腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉將每只大鼠麻醉,一旦麻醉,對照組大鼠用生理鹽水處理,其他組大鼠鼻內接種含有1×108CCU/mL的150 mL MP溶液,連續4天,每天一次,以制備MPP模型,MP檢測陽性即表示造模成功[8]。丙泊酚組、阿奇霉素組從末次接種日起腹腔注射丙泊酚10 mg/(kg·d)[9]或阿奇霉素25 mg/(kg·d)[8],連續4天。對照組和MPP模型組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水,丙泊酚+渥曼青霉素組在腹腔注射丙泊酚的同時尾靜脈注射15 ug/kg/day渥曼青霉素[7],連續4天。所有處理完成后,用40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后,通過心臟穿刺將血樣收集到含EDTA的血漿分離管中。隨后,用120 mg/kg戊巴比妥鈉對大鼠實施安樂死,并立即進行尸檢。收集大鼠的支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織以供進一步實驗。動物實驗得到本院機構動物護理和使用委員會的批準(2018論審第(WY19)號)。

2 血清MP-IgM和CRP水平檢測

將血樣離心后獲取血清,根據試劑盒方法檢測MP-IgM和CRP水平。

3 BALF中IL-6、IL-18和TNF-α表達測定

打開安樂死大鼠的胸腔,在左右支氣管分叉位點對右主氣管進行結扎。預冷的PBS進行3次右肺支氣管肺泡灌洗,每次回收約3.5 mL灌洗液(BALF)。離心收集上清液,經對應試劑盒方法檢測BALF中炎癥因子IL-6、IL-18和TNF-α的水平。

4 BALF中炎癥細胞的定量檢測

將BALF中的細胞懸浮在1 mL PBS中,并與0.4%臺盼藍染料以1 ∶1的比例混合,將10 μL懸浮液置于腔室載玻片,并將載玻片插入自動細胞計數器,進行總細胞計數。將細胞沉淀重懸以制備涂片用于染色。使用Wright-Giemsa染色對BALF中包括嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和巨噬細胞在內的炎癥細胞進行計數。簡而言之,通過用基于甲醇的Wright-Giemsa染色劑固定2 min,對載玻片進行染色。之后,將載玻片在Diff-Quik I溶液中染色5～10 s并立即取出。然后根據Diff-Quik全血染色試劑盒的說明,將載玻片在Diff-Quik II溶液中染色10～20 s并在室溫下立即取出。最后使用自動細胞計數器從隨機選擇的區域中對每個樣本的總共200～300個細胞進行計數。

5 肺濕干比

將大鼠安樂死后,通過鈍性解剖將氣管和食道與肺分開,使用PBS沖洗肺組織后稱重左肺的重量(濕重)。隨后在65℃進行48 h烘干,測量左肺的干重并計算濕重與干重的比率(肺濕干比)。

6 HE染色

制備常規石蠟肺組織切片,切片在40℃恒溫烘箱中干燥。脫蠟、水合后,將組織用蘇木精染色5 min,伊紅復染30～60 s,在光學顯微鏡下觀察以驗證顏色的變化。脫水后干燥、密封,在光學顯微鏡下觀察切片并評分。實質性肺炎評分基于炎性細胞肺泡浸潤程度[10],標準如下:0分,支氣管周圍無炎癥細胞;1分,支氣管周圍觀察到少量的炎癥細胞;2分,炎癥呈細胞層厚;3分,氣管周圍有兩到四層細胞層厚的炎癥;4分,氣管周圍炎癥呈四層細胞厚。

7 TUNEL檢測

將肺組織切片自然干燥,用二甲苯脫蠟并用梯度酒精溶液水合。添加50 μL TdT酶反應溶液中,避光孵育60 min。隨后,將組織切片上添加50 μL Streptavidin-TRITC標記溶液孵育30 min。通過DAPI溶液復染15 min,用封固劑密封后在顯微鏡下觀察。Image J軟件對圖像中的TUNEL陽性細胞進行計數,并計算細胞凋亡率(TUNEL陽性細胞數量/總細胞數量×100%)。

8 Western Blot分析

收集大鼠肺組織,并用RIPA裂解液裂解。SDS-PAGE電泳分離蛋白質并轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。然后將膜與一抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt和β-actin在4℃下過夜孵育[11]。將HRP標記的二抗孵育2 h。ECL用于可視化印跡,并用Image J軟件分析灰度值,β-actin作為內參對照。

三、統計學分析

結 果

一、丙泊酚降低MPP模型大鼠血清MP-IgM和CRP水平

(表1)結果顯示,MPP模型組血清MP-IgM和CRP水平較對照組顯著升高(P<0.05)。此外,丙泊酚或阿奇霉素治療后顯著降低了MPP模型大鼠中MP-IgM和CRP的血清水平(P<0.05);而丙泊酚與阿奇霉素對MP-IgM和CRP水平的影響無統計學差異(P>0.05)。在使用渥曼青霉素干預后可明顯逆轉丙泊酚對MPP模型大鼠中MP-IgM和CRP的血清水平的抑制作用(P<0.05)。

表1 丙泊酚對MPP模型大鼠血清MP-IgM和CRP水平的影響

二、丙泊酚抑制MPP模型大鼠BALF的炎癥反應

(表2)結果顯示,與對照組比較,MPP模型組大鼠BALF中炎癥因子IL-6、IL-18和TNF-α水平顯著上調;另外嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數量均明顯增多(P<0.05)。與MPP模型組比較,丙泊酚組或阿奇霉素組大鼠BALF中炎癥因子水平明顯降低;此外,嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數量均明顯減少(P<0.05)。與丙泊酚組比較,阿奇霉素組大鼠BALF中炎癥因子水平變化以及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數量變化無顯著差異(P>0.05):而丙泊酚+渥曼青霉素組大鼠BALF中炎癥因子水平以及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數量明顯增加(P<0.05)。

表2 丙泊酚對MPP模型大鼠BALF中炎癥因子水平和炎癥細胞數量的影響

三、丙泊酚改善MPP模型大鼠肺組織損傷

(表3)結果顯示,MPP模型組大鼠肺濕干比較對照組明顯上調(P<0.05);相比之下,與MPP模型組比較,丙泊酚組或阿奇霉素組顯著降低大鼠肺濕干比(P<0.05);此外,丙泊酚對大鼠肺濕干比的抑制作用可被渥曼青霉素減弱(P<0.05)。

表3 丙泊酚對MPP模型大鼠肺濕干比以及肺組織病理性損傷的影響

HE染色結果顯示,對照組支氣管、肺泡和血管未見明顯病變,肺泡壁未見明顯異常,肺組織未見炎癥細胞浸潤;而MPP模型組大鼠肺泡結構較松散,肺泡壁因水腫而增厚,肺組織出現大量炎癥細胞浸潤;相比于MPP模型組,丙泊酚組或阿奇霉素組肺泡結構和肺組織壁增厚顯著減少,炎癥細胞浸潤減少(見圖1)。然而,丙泊酚對肺組織病理損傷的積極作用被渥曼青霉素阻斷。此外,根據炎癥浸潤評分標準評估肺組織損傷,與對照組比較,MPP模型組大鼠炎癥浸潤評分明顯升高(P<0.05);與MPP模型組比較,丙泊酚組或阿奇霉素組大鼠炎癥浸潤評分顯著下調(P<0.05);與丙泊酚組比較,阿奇霉素組大鼠炎癥浸潤評分變化無顯著差異(P>0.05),丙泊酚+渥曼青霉素組大鼠炎癥浸潤評分顯著增加(P<0.05)。

圖1 HE染色檢測丙泊酚對MPP模型大鼠肺組織病理性損傷的影響(×200,箭頭表示炎性細胞浸潤)

四、丙泊酚抑制MPP模型大鼠肺組織細胞凋亡

(圖2和表4)結果顯示,與對照組比較,MPP模型組肺組織中TUNEL陽性細胞數量明顯增加,細胞凋亡率升高(P<0.05);與MPP模型組比較,丙泊酚組或阿奇霉素組TUNEL陽性細胞數量明顯減少,細胞凋亡率降低(P<0.05);與丙泊酚組比較,阿奇霉素組細胞凋亡率變化無顯著差異(P>0.05);丙泊酚+渥曼青霉素組TUNEL陽性細胞數量明顯增多,細胞凋亡率升高(P<0.05)。

圖2 TUNEL染色檢測丙泊酚對MPP模型大鼠肺組織細胞凋亡的影響(×400)

表4 丙泊酚對MPP模型大鼠肺組織細胞凋亡的影響

五、丙泊酚激活MPP模型大鼠中PI3K/Akt信號通路

(圖3和表5)結果顯示,與對照組比較,MPP模型組肺組織中磷酸化的PI3K和Akt蛋白相對水平明顯降低(P<0.05);與MPP模型組比較,丙泊酚組或阿奇霉素組磷酸化的PI3K和Akt蛋白相對水平明顯升高(P<0.05);與丙泊酚組比較,阿奇霉素組磷酸化的PI3K和Akt蛋白相對水平變化無顯著差異(P>0.05),而丙泊酚+渥曼青霉素組磷酸化的PI3K和Akt蛋白相對水平明顯降低(P<0.05)。

圖3 Western Blot檢測丙泊酚對MPP模型大鼠肺組織PI3K/Akt信號通路的影響1～5依次表示為對照組、MPP模型組、丙泊酚組、阿奇霉素組和丙泊酚+渥曼青霉素組

表5 丙泊酚對MPP模型大鼠肺組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值的影響

討 論

MPP是一種兒童常見的呼吸道疾病,其發病率正在逐漸增加[12]。MP是一種最小、最簡單的自我復制細菌,無細胞壁,其生存依賴于宿主的營養交換。MP侵入人體后可通過與宿主細胞膜融合誘導機體免疫反應[13]。隨著對MPP的不斷研究,多種包含阿奇霉素等大環內酯類藥物可用作一線治療藥物,但由于耐藥導致治療效果有限,并且單獨使用阿奇霉素治療還可誘發難治性的MPP[14]。因此,尋找MPP的理想治療方案尤為關鍵。

MP特異性IgM的鑒定是臨床上用于診斷MP感染的廣泛指標[15]。本研究顯示,丙泊酚后可明顯降低MPP大鼠MP-IgM水平,提示丙泊酚抑制MP生長。另外,CRP不僅是一種急性期反應蛋白,也是一種促炎因子,在機體發生炎癥反應或感染時高表達,也是診斷MPP發生的關鍵性指標之一[16-17]。結果顯示,丙泊酚降低了MP感染誘發的血清中CRP的高表達。現有的研究和報告顯示,IL-6等炎性因子是CRP合成的主要因素[18]。以上這些炎癥已被證實在MPP中高表達,且與多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病相關。于是,本研究檢測了用或不用丙泊酚處理的MPP大鼠BALF中炎癥因子的水平和炎癥細胞的數量以探究丙泊酚與MPP大鼠炎癥反應之間的關系。結果表明,丙泊酚不僅減少了MPP大鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數量,并且降低了IL-6、IL-18和TNF-α水平。提示丙泊酚通過減少炎癥細胞的浸潤改善MP誘發的炎癥反應。進一步表明,丙泊酚減輕了MPP大鼠肺組織的病理損傷,降低了MPP大鼠肺組織中細胞凋亡率。以上結果表明,丙泊酚保護MP感染的大鼠免受炎癥和細胞凋亡損傷,然而其機制尚不明晰。

既往研究表明,PI3K/Akt信號通路在炎癥細胞募集、調節炎癥介質的表達以及氣道重塑等多種機體活動中發揮著至關重要的作用[19]。據報道,激活PI3K/Akt信號可通過抑制炎癥和纖維化的發生發揮心臟保護作用[20]。另外,線粒體ATP敏感性鉀離子通道通過激活哮喘大鼠模型中PI3K/Akt信號通路增加氣道平滑肌細胞增殖[21]。為闡明PI3K/Akt通路激活是否參與丙泊酚對MP感染所致的肺損傷的保護作用。本研究通過檢測PI3K和Akt磷酸化水平發現,丙泊酚可上調MPP模型大鼠肺組織中PI3K和Akt磷酸化水平;而在使用PI3K抑制劑渥曼青霉素處理后不僅抑制了丙泊酚對PI3K和Akt磷酸化水平的促進作用,并且削弱了丙泊酚對MPP大鼠的保護作用。以上這些結果表明,PI3K/Akt通路參與了丙泊酚對MP誘導的肺損傷的保護作用。

綜上,丙泊酚能夠通過下調血清MP-IgM和CRP水平、抑制BALF中炎癥因子水平和減少炎癥細胞數量、同時削弱肺組織的炎癥浸潤和病理變化以及抑制細胞凋亡改善MP所致的肺損傷。值得注意的是,丙泊酚的這些保護特性可以通過激活PI3K/Akt信號通路來實現。然而,本研究還存在一些局限性,首先,渥曼青霉素只能部分逆轉丙泊酚的保護作用,表明除了PI3K/Akt通路,丙泊酚可能還存在其他保護機制;其次,僅使用了渥曼青霉素研究了PI3K/Akt信號通路在當前研究中的作用,而PI3K或Akt基因敲除模型或RNA干擾技術也可考慮應用于進一步研究,這將有利于證明此通路在丙泊酚保護MP誘導的肺損傷中的具體作用。