菌根真菌對鐵皮石斛幼苗的促生作用研究

摘要 本研究從鐵皮石斛、兜唇石斛和報春石斛等23種石斛屬植物的健康根系中分離純化菌根真菌菌株68株，通過接種鐵皮石斛盆栽幼苗進行共生培養，篩選出促生效果顯著的真菌11株。結果表明，促生菌根真菌能明顯提高鐵皮石斛幼苗的成活率和生長率，顯著提高鐵皮石斛的葉綠素含量，降低丙二醛和過氧化物酶含量，提高鐵皮石斛的抗逆性，對鐵皮石斛的生長起到促進作用。

關鍵詞 菌根真菌；鐵皮石斛；幼苗促生

中圖分類號 S567.239 文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）23-24-0041-05

Promoting effect of mycorrhizal fungi on Dendrobium officinale seedlings

YANG Hetong " "SUN Mingyu " "XI Gangjun*

（Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry， Jurong 212400， China）

Abstract The 68 strains of mycorrhizal fungi were isolated and purified from the healthy roots of 23 species of Genus Dendrobium， including Dendrobium officinale， Dendrobium aphyllum， Dendrobium primulinum， and 11 strains of fungi with prominent promoting effects were screened by symbiotic culture with Dendrobium officinale seedlings. The results showed that mycorrhizal fungi could significantly increase the survival rate and growth rate of Dendrobium officinale seedlings， significantly increase the chlorophyll content of Dendrobium officinale， reduce the malondialdehyde and peroxidase content， improve the stress resistance of Dendrobium officinale， and promote the growth of Dendrobium officinale.

Keywords mycorrhizal fungi; Dendrobium officinale; seedling promotion

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為多年生附生蘭，是一種珍貴的藥食同源植物，富含石斛堿、多糖和苯丙素等對人體有益的物質[1]。屬于二級保護植物，具有較大的藥用價值。其種子細小無胚乳，自然條件下需要與真菌共生才能完成其生活史[2]。近年來，隨著鐵皮石斛組培和栽培技術的發展，鐵皮石斛產業規模迅速擴大，現有的鐵皮石斛以大棚集約化栽培為主，栽培設施投入大，成本較高，產品質量尚待提高。本試驗通過從自然生長的健康石斛根系上分離篩選出對鐵皮石斛有促生作用的菌根真菌，并測定相關生理生化指標，探索其促生的作用機制，為鐵皮石斛專用生物菌肥的開發提供菌株材料和理論參考，降低鐵皮石斛栽培種植成本，提高種苗移栽成活率，提升品質，減少化肥農藥的施用，為鐵皮石斛的有機栽培提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 "本試驗所用鐵皮石斛、齒瓣石斛（Dendrobium devonianum Paxt.）、尖刀唇石斛（Dendrobium heterocarpum Lindl.）、報春石斛（Dendrobium primulinum Lindl.）、串珠石斛（Dendrobium falconeri Hook.）等23種石斛屬植物均采自云南省，詳見表1。將采集的石斛新鮮根放入密封袋中，分別進行編號，保存在4 ℃冷藏箱內，供分離菌根真菌使用；接種試驗使用的鐵皮石斛組培苗由江蘇農林職業技術學院生物工程技術中心提供。

1.1.2 試劑 "葉綠素試劑盒購自蘇州格銳思生物科技有限公司，無水乙醇（分析純）、磷酸（分析純）、硫代巴比妥酸（分析純）、DE共生培養基和N6培養基等藥品均購自國藥集團。

1.1.3 儀器設備 "試驗用Sigma 3K30高速冷凍離心機，日本島津UV1280分光光度計，寧波賽福PRX-250A智能人工氣候箱，上海一恒HWS-28水浴鍋，上海博迅YXQ-LS-75SII高壓蒸汽滅菌鍋，蘇州安泰SW-CJ-2FD超凈工作臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌根真菌的分離與純化 "剪取石斛根部3～5 cm，流水沖洗1～2 h，在超凈工作臺上用70%乙醇浸潤30 s，用2%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，無菌水沖洗4次，將其切成0.2～0.5 cm的小段，接種于馬鈴薯蔗糖瓊脂（PDA）培養基中，5～6段/皿，置于（25±1） ℃恒溫箱中培養5～7 d[3]，挑取不同菌落邊緣菌絲接種于PDA培養基中繼續培養[4-5]。重復上述步驟，直至平板內菌落顏色、形態一致，接種于PDA試管內的斜面上，并進行編號，長滿斜面后，保存于4 ℃冷藏箱中。

1.2.2 菌根真菌的初篩 "把純化后的真菌菌株接種到PDA培養基中，于（25±1） ℃恒溫箱中培養5 d，待菌絲布滿培養基表面后，用φ6 mm打孔器，在菌落邊緣打成菌餅備用。先將鐵皮石斛組培苗轉接到DE共生培養基中，5株/瓶，再接入真菌菌餅，4個重復，于寧波賽福PRX-250A智能人工氣候箱中培養90 d，溫度為（25±1） ℃，光照為1 500 lx，光暗循環為12 h/d，選擇能與鐵皮石斛形成共生關系的菌種作為試驗備用菌種。

1.2.3 生長指標測定 "將初篩后不同菌種的菌餅接入含有鐵皮石斛幼苗的組培瓶內，待菌絲布滿培養基表面后，迅速將鐵皮石斛苗從瓶中取出，洗凈根部，稱重后移栽入鐵皮石斛栽培基質中，4株/叢，4個重復，放在組培溫室中培養，以不接菌種的組培苗為對照。120 d后稱量植株鮮重，統計凈生長量和生長率等生長指標，丙二醛（MDA）、葉綠素及過氧化物酶（POD）含量分別采用硫代巴比妥酸法[6]、葉綠素含量測定試劑盒和POD含量測定試劑盒進行測量分析。

1.2.4 數據統計 "生長指標和生理指標數據采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 菌根真菌的分離純化

從不同石斛的健康根系共分離、純化得到真菌菌株68株，部分菌株菌落形態見圖1。

2.2 菌根真菌的初篩

將鐵皮石斛組培苗與分離得到的真菌共生培養后發現，不同真菌對鐵皮石斛生長的影響差異較大，少量鐵皮石斛組培苗葉色較綠，根系生長較旺盛，大量鐵皮石斛組培苗表現為葉色黃，葉片被菌絲覆蓋包裹而死亡。根據鐵皮石斛組培苗的生長情況從中篩選出與鐵皮石斛能形成共生關系的真菌菌株33株。

2.3 不同菌根真菌對鐵皮石斛生長指標的影響

用不同的菌根真菌對鐵皮石斛組培苗進行接菌處理，然后將鐵皮石斛組培苗移入基質中培養120 d，不同菌根真菌接菌處理的鐵皮石斛幼苗表現出不同的生長情況。33株菌根真菌中篩選出11株菌株對鐵皮石斛有促生作用，其中DCsh-4和QHsh-5菌株對鐵皮石斛幼苗的促生效果最為明顯，接種該菌株的鐵皮石斛幼苗出現許多新的分蘗，長成新的植株，莖葉濃綠，葉片較大（圖2）；接入CZsh-3-4和QHsh-5菌株的鐵皮石斛幼苗莖稈明顯增粗伸長，并出現開花現象（圖3）。即DCsh-4、QHsh-5和CZsh-3-4這3株菌株能提高鐵皮石斛分蘗能力和根系生長。

對用不同菌根真菌處理的鐵皮石斛幼苗的凈生長量和生長率進行統計，11株處理苗的幼苗平均生長率均高于CK，且與CK相比，DCsh-4、GSsh-15、CZsh-3-4、QHsh-3、QHsh-15和NBsh-1-3接種的鐵皮石斛生長率顯著提高（表2）。

2.4 不同菌根真菌對鐵皮石斛生理指標的影響

2.4.1 葉綠素含量 "不同菌根真菌對鐵皮石斛葉綠素含量的影響不同（表3）。11株菌根真菌處理的鐵皮石斛幼苗葉色濃綠，生長健壯，葉綠素含量均高于CK。其中CZsh-3-2和LBsh-2-4菌根真菌處理的鐵皮石斛幼苗，葉綠素含量顯著高于CK，其葉綠素平均積累量達1.235和1.234 mg/g。這說明鐵皮石斛促生菌根真菌能夠提高鐵皮石斛的葉綠素含量，進而提高鐵皮石斛光合作用能力，促進有效成分的合成和積累，提高鐵皮石斛的品質，這與李景蕻等[7]的研究結果一致。

2.4.2 丙二醛（MDA）含量 "MDA含量的變化是植物質膜損傷程度的重要標志，MDA含量的高低表示植物細胞膜脂過氧化程度，是反映鐵皮石斛抗氧化能力的重要參數[8-10]，在鐵皮石斛中，MDA的含量越小說明其抗氧化能力越強。在11株菌根真菌處理的鐵皮石斛幼苗中，除NBsh-1-3外，其他所有處理MDA含量均低于CK。特別是LBsh-2-4菌根真菌接菌處理鐵皮石斛幼苗中MDA的含量顯著低于CK，均值為8.957 mmol/（g·FW）（表3）。促生菌根真菌能提高鐵皮石斛的抗氧化能力，增強對環境的適應性，增強抗逆性。

2.4.3 過氧化物酶（POD）活性 "POD活性在植物生長發育過程中不斷發生變化[11]。一般在老化組織中活性較強，幼嫩組織中活性較弱[12]，即POD活性反映植物老化程度。11株促生菌根真菌處理的鐵皮石斛幼苗POD活性均低于CK，其中，QHsh-3和NBsh-1-6菌根真菌接菌處理的鐵皮石斛幼苗中POD活性較CK顯著降低，均值為2.167和2.333 IU/mL。促生菌根真菌有利于鐵皮石斛延緩老化，保持旺盛生長。

3 結論與討論

本試驗從23種石斛屬植物根系中分離純化菌根真菌68株，將其接種到DE共生培養基中與鐵皮石斛組培苗共生培養，初步篩選出與鐵皮石斛共生的菌根真菌33株。通過鐵皮石斛菌根化栽培與接種菌餅栽培后進行生長特性、相關酶活測定等篩選出促生菌根真菌11株。本試驗分離篩選出的11株菌株能與鐵皮石斛幼苗生長形成共生關系，其中明顯提高鐵皮石斛幼苗生長率的菌株是DCsh-4、QHsh-5、CZsh-3-4和QHsh-3等；明顯提高鐵皮石斛幼苗葉綠素含量的菌株是CZsh-3-2、LBsh-2-4、NBsh-1-3和CZsh-3-4等；明顯降低MDA含量的菌株有LBsh-2-4、NBsh-1-6、NBsh-1-25和GSsh-14-1等；明顯降低POD活性的菌株是QHsh-3、NBsh-1-6、NBsh-1-25和DCsh-4等。通過生長率、葉綠素、MDA和POD等指標測定，對鐵皮石斛促生作用顯著的菌株有DCsh-4、CZsh-3-4、QHsh-3、LBsh-2-4、NBsh-1-6和NBsh-1-25。

鐵皮石斛幼苗接種菌根真菌后，表現出的促生作用不盡相同，有些菌株能促進幼苗生長，有些能降低其MDA和POD活性。DCsh-4和QHsh-3菌株既提高了生長率又降低POD活性；CZsh-3-4菌株既提高了生長率又增加了葉綠素含量；LBsh-2-4菌株既增加了葉綠素含量又降低了MDA含量；NBsh-1-6和NBsh-1-25菌株都降低了MDA含量和POD活性。這說明菌根真菌作用于鐵皮石斛幼苗，有些菌株能促進生長，有些能提高其抗逆性，篩選出的6種真菌既能促生又能增強其幼苗抗逆性。在今后的試驗中，可進一步確定其作用機理。

本試驗中接菌僅用了單一的菌株，而鐵皮石斛根系中分離菌根真菌時，常能從單株中分離出2種或2種以上的真菌，說明共生真菌在鐵皮石斛根系中普遍存在。促生作用可能是多種菌根真菌共同作用的結果，后期的試驗中可進行2種及以上的菌株混合接種，并進行相關指標測定，以探索混合接種對鐵皮石斛幼苗的促生作用效果。

本試驗篩選出的促生菌株未進行分子鑒定和生物學特性觀察，后期試驗需鑒定出具體的種名及生物學特性觀察，以便進一步揭示菌根真菌的特性，有利于后期開發專用的菌根真菌菌劑、菌肥，應用于大田生產栽培。

參考文獻

[1] 李墅. 石斛中生物堿類及多糖化學成分質量研究[D]. 北京：北京協和醫學院，2005.

[2] 田思源. 鐵皮石斛組織培養的工藝條件研究[J]. 科技資訊，2012，10（8）：107.

[3] 王玉珍. 雪桃的組織培養與繁殖[J]. 植物生理學通訊，1992，28（1）：51-52.

[4] 金輝，許忠祥，陳金花，等. 鐵皮石斛組培苗與菌根真菌共培養過程中的相互作用[J]. 植物生態學報，2009，33（3）：433-441.

[5] 李景蕻，張麗華，鄧櫻花，等. 鐵皮石斛組培苗菌根真菌接種效應[J]. 基因組學與應用生物學，2019，38（9）：4135-4141.

[6] 王玲，唐德強，王佳佳，等. 鐵皮石斛原球莖與野生鐵皮石斛多糖的抗菌及體外抗氧化活性比較[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2016，44（6）：167-172，180.

[7] 李景蕻，張麗華，鐘靜，等. 不同菌根真菌對鐵皮石斛穴盤苗生長及生根的影響[J]. 華北農學報，2022，37（增刊1）：172-177.

[8] 何開躍，李曉儲，黃利斌，等. 冷凍脅迫對福建柏苗可溶性糖和丙二醛（MDA）含量的影響[J]. 江蘇林業科技，2000，27（6）：6-8.

[9] 譚艷玲，張艷嫣，高冬冬，等. 低溫脅迫對鐵皮石斛抗壞血酸過氧化物酶活性及丙二醛和脯氨酸含量的影響[J]. 浙江大學學報（農業與生命科學版），2012，38（4）：400-406.

[10] 張艷嫣. 外源硒對低溫脅迫下鐵皮石斛幼苗的緩解效應及其抗氧化生理特征的變化[D]. 杭州：浙江大學，2013.

[11] 王靜. 三種植物的組織培養及生根過程中酶活性的變化[D]. 大連：遼寧師范大學，2008.

[12] 周曉麗，楊文杰，奚春榮，等. 薏苡的組織培養及其過氧化物酶分析[J]. 東北師大學報（自然科學版），1991，23（1）：99-102，40.

（責編：李 媛）