畜禽糞便和土壤中典型抗生素SPE-UPLC-MS/MS檢測方法的建立

摘 要：應用固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜（solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry， SPE-UPLC-MS/MS）技術，建立了同時測定畜禽糞便和土壤中磺胺類（sulfonamides， SAs）、喹諾酮類（quinolones， QNs）及大環內酯類（macrolides， MACs）等22種獸用抗生素殘留的分析方法。樣品經McIlvaine-EDTA-2Na緩沖液和乙腈-甲醇 （體積比1∶1）溶液提取，Oasis HLB固相萃取柱凈化，電噴霧正電離源（positive electron spray ionization， ESI+）和多反應監測（multiple reaction monitoring， MRM）進行檢測，外標法定量。研究結果表明：22種抗生素的濃度在0.005～0.5μg·mL^-1時具有良好的線性關系;平均回收率為61.4％～93.3％，相對標準偏差為2.62％～13.8％;檢出限為0.1～1.1μg·kg^-1，定量限為0.3～3.6μg·kg^-1。該方法可同時實現畜禽糞便和土壤中22種抗生素的準確定性、定量分析。

關 鍵 詞：抗生素; 超高效液相色譜-串聯質譜; 畜禽糞便; 固相萃取

中圖分類號：S141;X502 文獻標志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-5862.2023.02.004

Establishment the method of SPE-UPLC-MS/MS for detecting common antibiotics in livestock manures and soil aquatic environment

LIU Yu^1，2， WANG Yonggang³， LYU Hongying²， LI Jie¹， FU Haibin²， HAN Xiaohu¹， JIANG Feng¹， WANG Haiyan⁴， JIANG Li³， ZHANG Min¹

（1. College of Engineering， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China; 2. Technology Center of Shenyang Customs， Shenyang 110016， China; 3. Shenyang Customs， Shenyang 110179， China; 4. Technology Center of Hohhot Customs， Hohhot 010020， China）

Abstract：A method for the analysis of 22 verterinaryantibiotics residue including sulfonamides（SAs），quinolones（QNs） and macrolides（MACs） in livestock manures was developed based on solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（SPE-OPLC-MS/MS）. Samples were extracted with McIlvaine-EDTA-2Na buffer and methanol-acetonitrile（1∶1，V/V） solution. Extraction liquid was purified by an Oasis HLB SPE column. Quantitative analysis was performed using multiple reaction monitoring mode（MRM）. External standard method was adopted as the quantitative method. The calibration curves show good linearity within the concentrations of 0.005～0.5μg·mL^-1. The averaged recoveries of 22 verterinaryantibiotics are ranged from 61.4% to 93.3%. The relative standard deviations are both less than 2.62%～13.8%.The detected limits （LOD） are 0.1～1.1μg·kg^-1， limit of quantification （ LOQ） are 0.3～3.6μg·kg^-1. This method can achieve simultaneously and accurate qualitative and quantitative analysis of 22 kinds of antibiotics in livestock manure and soil by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Key words：antibiotics; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; livestock manures; solid phase extraction

基于預防疾病和促進生長的目的，獸用抗生素被廣泛應用于畜禽養殖業中^［1-2］，由于獸用抗生素不能完全被動物體吸收，約30%～90%的抗生素將隨著畜禽糞便排泄出來^［3-4］。目前，我國獸用抗生素年均消費已達6000t^［5］，畜禽糞便及其養殖場周邊環境中的獸用抗生素污染已經達到較為嚴重的程度，有學者調查研究發現，廣東、北京、江蘇、內蒙古、天津、福建、浙江等地區土壤及畜禽糞便中抗生素殘留均有不同程度的檢出，有些地區抗生素殘留已達到了mg·kg^-1級^［6-9］。畜禽糞便中殘留的過量抗生素通過施肥進入環境中，對農田土壤、地表和地下水及生態系統中各類生物產生危害，并誘發和傳播各類抗生素耐藥細菌，嚴重影響生態環境和人類健康^［10-12］。

對畜禽糞便、土壤等環境基質中的獸藥殘留進行監測的一個重要手段就是建立能夠快速、準確地進行殘留物檢測的方法。液相色譜法是一種較為常用的方法^［13-15］，但其前處理比較復雜，由于土壤和畜禽糞便基質復雜，檢測分析時會受到較大干擾，因而需建立有效的前處理方法以減少干擾^［14］。超高效液相色譜-串聯質譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）具有檢測范圍寬、靈敏度高、抗干擾能力強等特點^［16-25］，正逐步用于環境基質中抗生素的檢測。為此，針對現有抗生素檢測方法主要針對畜禽產品，而畜禽糞便和土壤基質中有多種抗生素殘留且檢測方法研究較少的現狀，本研究運用UPLC-MS/MS技術，建立了同時測定土壤和畜禽糞便中磺胺類、喹諾酮和大環內酯類的22種獸用抗生素殘留的分析方法，該方法靈敏度高、準確度高、重現性好，可用于土壤和糞便中抗生素殘留監測并為抗生素污染治理提供技術保證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：液相色譜串聯質譜儀（美國Waters公司）;固相萃取裝置（美國Supelco公司）;固相萃取柱（美國Waters公司）;Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）;BSA822電子分析天平（德國Sarturius公司）;Z323K高速離心機（德國Hermle公司）;XW-80A旋渦混合儀（上海楚定分析儀器）;MG-2200氮吹儀（日本EYELA公司）。

試劑：甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉均為分析純;實驗用水均為超純水。

標準品：磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathiazole，STZ）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SMR）、磺胺二甲嘧啶（sulfadimidine，SM2）、磺胺氯噠嗪（sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺甲噁唑（sulphamethoxazole，SMX）、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺異噁唑（sulfafurazole，SFZ）、磺胺苯甲酰（sulfabenzamide，SBZ）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazolum，SPZ）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，SQ）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、噁喹酸（oxollinic acid，OA）、氟甲喹（flumequene，FLU）、林可霉素（lincomycin，LI）、螺旋霉素（spiramycin，SP）、吉它霉素（kitasamycin，KI）、泰樂菌素（tylosin，TYL）、克林霉素（clindamycin，CL），所有化學標準品購自德國Dr. Ehrenstorfer（純度均≥96%）。

標準溶液的配制：分別精確稱取10mg的標準品（精確到0.0001g）于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋溶解，配制成1g·L^-1的標準儲備液，4℃冰箱內密封、避光保存。

McIlvaine-EDTA-2Na緩沖液配置：將1L的0.1mol·L^-1的檸檬酸溶液和625mL的0.2mol·L^-1的磷酸氫二鈉混勻，并加入60.5g的EDTA-2Na溶解后混合均勻，用0.3mol·L^-1的NaOH溶液調節pH至4.0左右^［15-16］。

1.2 樣品提取與凈化

畜禽糞便樣品：采集新鮮畜禽豬糞避光密封，于2h內帶回實驗室在-18℃保存，樣品經冷凍干燥粉碎研磨，過60目篩。稱取1g（精確至0.01g）樣品置于50mL具塞離心管中，先加入5mL McIlvaine-EDTA-2Na緩沖液，震蕩混勻后再加入10mL甲醇-乙腈 （1∶1，V/V）提取液，常溫超聲20min后，振蕩30min，5000r·min^-1離心15min，收集上清液。再分別用McIlvaine-EDTA-2Na緩沖液和甲醇-乙腈（1∶1，V/V）提取液重復提取2次，合并3次提取液，40℃水浴旋轉蒸發濃縮至10mL左右，取5mL濃縮液，用超純水稀釋至10mL，過0.45μm纖維濾膜后，進行固相萃取。

土壤樣品：土樣采自沈陽農業大學玉米試驗田0～20cm 的表層土壤。自然風干，研磨干燥土樣，過60目篩，備用。稱取1g（精確至0.01g）樣品置于50mL具塞離心管中，其余處理過程與上述畜禽糞便處理方法相同。

依次用5.0mL甲醇及10.0mL超純水活化Oasis HLB SPE萃取柱（Waters，500mg/6mL），上樣后，用5mL超純水淋洗萃取柱并抽干，再用10.0mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40℃條件下氮氣吹干后，1mL 20%甲醇定容，過0.22μm的微孔濾膜，待測定。

1.3 檢測條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱（100mm×2.1mm，1.7μm）。流動相：A為0.2％甲酸，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～2min，5%B;2～8min，5%～25%B;8～14min，25%～42%B;14～30min，42%～95%B;30～32min，95%B;32～35min，5%B。柱溫：40℃。流速：0.2mL·min^-1。進樣體積：10μL。

1.3.2 質譜條件

電離方式為ESI+;電離電壓為3.0kV;離子源溫度為100℃;脫溶劑溫度為300℃;脫溶劑氣流量為500L·h^-1;錐孔反吹氣流量為50L·h^-1;采集方式為多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式。

2 結果與討論

2.1 固相萃取條件的優化

本實驗采用固相萃取凈化技術對畜禽糞便樣品提取液進行凈化，分別考察了Oasis HLB（500mg/6mL），C18 （500mg/6mL），Oasis MCX（500mg/6mL） 3種固相萃取柱對豬糞樣品中8種抗生素的凈化效果，實驗結果見表1。結果表明，采用Oasis HLB固相萃取柱凈化后含抗生素的樣品回收率較高。HLB固相萃取填料的主要成分是二乙烯苯和親水性的N-乙烯基吡咯烷酮2種單體按照一定比例聚合而成的大孔聚合物， 吸附量較大， 適合于大多數有機化合物的提取， 重現性和穩定性也較好。

實驗也考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯的洗脫效果，結果表明甲醇作為洗脫液時多種抗生素均具有較好的回收率。同時，當甲醇的用量為10mL時，洗脫液對目標抗生素洗脫完全，且洗脫速度為1.0mL·min^-1時洗脫效果較好。

2.2 色譜條件的優化

為提高目標物正離子化效率，以甲醇-0.2%甲酸為流動相，采用梯度淋洗的方式，優化了色譜流動相梯度。

2.3 質譜條件的優化

實驗采用三通方式，在ESI+模式下分別對0.1mg·L^-1的22種抗生素單標標準工作液進行一級質譜全掃描分析，確定分子離子峰，二級質譜以分子離子為母離子，選擇定量和定性2個子離子，同時優化錐孔電壓和碰撞能量，最終確定質譜參數，結果見表2。

2.4 線性范圍和方法檢出限

用空白基質溶液制備濃度分別為0.005，0.02，0.05，0.2，0.5μg·mL^-1的各抗生素混合基質標準溶液，依照上述2.3質譜條件進行檢測分析，繪制22種抗生素的標準曲線，22種抗生素的線性回歸方程、相關系數、檢出限（limit of detection， LOD）（S/N=3）、定量限（limit of quantitation， LOQ）（S/N=10）見表3。從表3中可以看出，22種抗生素的檢出限為0.1～1.1μg·kg^-1，定量限為0.3～3.6μg·kg^-1，22種抗生素濃度為0.005～0.500μg·mL^-1時線性良好，相關系數（r）為0.9979～0.9997，滿足檢測的技術要求。

2.5 方法的回收率和精密度

在1g空白土壤、畜禽糞便樣品中分別添加22種抗生素混合標準溶液做加標回收實驗，添加濃度水平分別為0.02，0.05，0.5mg·kg^-1，每個樣品重復測定6次，考察方法的準確度和精密度，其回收率和相對標準偏差見表3。結果顯示，在3個加標水平上22種抗生素的平均回收率在61.4%～93.3%，相對標準偏差為2.62%～13.8%。由此可見，該方法的回收率和精密度滿足檢測技術要求。

3 結 論

本文建立了土壤和畜禽糞便中磺胺類、喹諾酮和大環內酯類等22種抗生素的固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜測定方法，可同時實現22種典型抗生素的定性、定量分析。采用SPE技術可有效去除糞便、土壤等復雜樣品中的雜質，方法簡單快速，靈敏度高，重現性好，滿足實驗分析要求，可用于土壤和畜禽糞便中磺胺類、喹諾酮和大環內酯類藥物殘留的同時測定，為土壤和畜禽糞便中抗生素殘留監控提供技術支持。

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