水稻惡苗病拮抗細(xì)菌的篩選及生防機(jī)制

摘 要：從稻蟹生態(tài)種養(yǎng)水稻根際土壤中分離得到3株對(duì)水稻惡苗病具有防治作用的拮抗細(xì)菌，其防治效果可分別達(dá)到69%，60%，62%。經(jīng)鑒定，3株拮抗細(xì)菌分別為解淀粉芽孢桿菌J2（Bacillus amyloliquefaciens）、芽孢桿菌屬J3（Bacillus sp.）和枯草芽孢桿菌F3（Bacillus subtilis）。3株拮抗細(xì)菌均可代謝產(chǎn)生蛋白酶與纖維素分解酶，致使病原菌菌絲頂端部分膨大，從而抑制菌絲生長(zhǎng)，降低惡苗病發(fā)病率。拮抗細(xì)菌也可同時(shí)促進(jìn)水稻苗期光合作用和生物量的增加，誘導(dǎo)水稻超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性提高，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量下降，進(jìn)而提高水稻防御能力，降低病害發(fā)生。3株拮抗細(xì)菌均表現(xiàn)出對(duì)水稻惡苗病良好的防治效果，且對(duì)水稻生長(zhǎng)產(chǎn)生積極影響，具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。

關(guān) 鍵 詞：藤倉(cāng)鐮刀菌; 拮抗細(xì)菌; 生防機(jī)制

中圖分類號(hào)：S158.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-5862.2023.02.016

Screening of antagonistic bacteria against Fusarium fujikuroi in rice and biocontrol mechanism

TONG Deli¹， LIU Jinghua¹， YU Xin¹， ZHU Guangpeng¹， LI Mengqi¹， HE Haisheng²

（1. College of Life Science， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China;

2. Experimental Teaching Center， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China）

Abstract：Three antagonistic bacteria against Fusarium fujikuroi were isolated from rice rhizosphere soil cultivated by rice-crab ecological culture. They were identified as Bacillus amyloliquefaciens J2， Bacillus sp. J3 and Bacillus subtilis F3. All of them had good control effect on rice seedling malignant seedling disease， and the control effect reached 69%， 60% and 62%， respectively. All the three antagonistic bacteria could produce proteases and cellulolytic enzymes， which caused the apical part of the mycelium to expand， thus inhibiting the growth of mycelium and reducing the incidence of malignant seedling disease. Antagonistic bacteria could promote the photosynthesis and biomass of rice at seedling stage， induce the activities of superoxidedismutase （SOD）， peroxidase （POD） and catalase （CAT） in rice and decrease the activity of malondialdehyde （MDA）， thereby improving the defense ability of rice and reducing the occurrence of rice diseases. All the three antagonistic bacteria showed good control effect on rice malignant seedling disease， and had a positive effect on rice growth， which had certain development potential.

Key words：Fusarium fujikuroi; antagonistic bacteria; biocontrol mechanism

水稻作為我國(guó)第一大糧食作物，其種植與產(chǎn)量關(guān)乎國(guó)家糧食安全^［1］。然而，水稻病害的發(fā)生嚴(yán)重影響水稻的品質(zhì)與產(chǎn)量，常見(jiàn)的水稻真菌病害包括水稻基腐病、紋枯病、惡苗病、稻瘟病、白葉枯病等^［2-6］。其中，水稻惡苗病在中國(guó)稻區(qū)分布廣泛，該病主要由藤倉(cāng)鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）和層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）引起，二者分布最廣、致病力最強(qiáng)^［7］。水稻惡苗病在水稻苗期的癥狀包括徒長(zhǎng)、葉片細(xì)長(zhǎng)呈淡綠色、矮化、死苗等，在成株期引起根部和莖基部腐爛，嚴(yán)重時(shí)整株枯死^［8］，該病爆發(fā)后，一般造成水稻減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)50%^［9-10］。

目前，控制水稻真菌病害主要以化學(xué)殺菌劑為主，但其具有潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，因而生物防治已經(jīng)成為控制植物病害的理想方法^［11-12］。學(xué)者已經(jīng)篩選出對(duì)植物霜霉病^［13-16］、黃瓜灰霉病^［17］、番茄灰霉病^［18-19］、水稻基腐病^［2］、水稻紋枯病^［3］、水稻稻瘟病^［5］、水稻白葉枯病^［6］等植物病害具有較好效果的拮抗微生物，但對(duì)水稻惡苗病的生物防治的報(bào)道較少。本研究以稻蟹生態(tài)種養(yǎng)田塊中水稻根際土壤細(xì)菌為材料，旨在篩選對(duì)水稻惡苗病具有防治作用的拮抗菌株，并研究其防治效果和對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品采自遼寧省盤山縣稻蟹共作田水稻根際，水稻惡苗病病原菌為藤倉(cāng)鐮刀菌（Fusarium fujikuroi），由沈陽(yáng)師范大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 拮抗細(xì)菌的分離、篩選與鑒定

拮抗細(xì)菌的分離采用稀釋平板法獲得細(xì)菌純培養(yǎng)^［20］。采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）平板對(duì)峙法篩選拮抗細(xì)菌，在平板采取2點(diǎn)對(duì)峙，一端接種1cm藤倉(cāng)鐮刀菌菌餅，將已分離純化的拮抗菌株分別點(diǎn)接在距離指示菌3cm處的點(diǎn)上，以不接拮抗菌株為對(duì)照，置于25℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。待對(duì)照菌株長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，測(cè)定菌絲生長(zhǎng)距離，計(jì)算抑菌率^［20］：

菌株鑒定結(jié)合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》^［21］與分子測(cè)序方法^［22］，測(cè)序由蘇州泓迅生物科技股份有限公司完成。

1.2.2 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻苗期惡苗病的影響

稻種經(jīng)消毒、催芽后，每盆種植50粒水稻種子，25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用剪葉噴霧接種法，于兩葉一心期對(duì)水稻葉鞘部位進(jìn)行微傷口處理，對(duì)照接種惡苗病菌和無(wú)菌水，以CK表示;同時(shí)接種惡苗病菌和J2，J3，F(xiàn)3，菌懸液的處理以T1，T2，T3表示，每天早晚各接種一次，直至不流液，每個(gè)處理重復(fù)3次，連續(xù)接種15d后，調(diào)查水稻惡苗病的發(fā)病率^［23-24］。

1.2.3 拮抗細(xì)菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)水稻惡苗病菌絲生長(zhǎng)的影響

在9mL酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium， YEPD）培養(yǎng)基中加入1mL病原菌孢子懸浮液，150r·min^-1，25℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12h以獲得菌絲體。之后按照10%的終濃度加入菌株無(wú)菌發(fā)酵液，搖瓶培養(yǎng)24h后對(duì)藤倉(cāng)鐮刀菌的菌絲形態(tài)進(jìn)行顯微觀察，以不加菌株無(wú)菌發(fā)酵液為對(duì)照^［25］。

1.2.4 拮抗細(xì)菌相關(guān)代謝酶活性

參照關(guān)小敏^［20］的方法測(cè)定拮抗細(xì)菌蛋白酶、纖維素酶、果膠酶和幾丁質(zhì)酶活性。

1.2.5 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的影響

完成1.2.2實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，CK，T1，T2和T3各處理隨機(jī)選取3株水稻幼苗進(jìn)行株高、葉綠素含量和相關(guān)酶的測(cè)定。利用SPAD-502 Plus型葉綠素計(jì)測(cè)定葉片葉綠素含量，測(cè)定時(shí)選取不同葉片的相同位置;利用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量;愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性;紫外比色法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的篩選鑒定

2.1.1 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻惡苗病的拮抗效果

從水稻根際土壤中初篩得到具有惡苗病菌拮抗能力的細(xì)菌24株，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選，最終獲得3株具有穩(wěn)定拮抗能力的菌株，將其分別編號(hào)為J2，J3，F(xiàn)3。由表1可見(jiàn)，3株拮抗細(xì)菌的抑菌率基本在50%以上。其中，J2的拮抗效果顯著高于其他菌株（Plt;0.05），抑菌率達(dá)到了60%，J3和F3的抑菌率分別為48%和52%。

2.1.2 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

3株拮抗細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，NA）中培養(yǎng)24h， 菌落均呈乳白色、近圓形凸起，前期表面光滑、邊緣整齊、不透明、易挑取。菌體均呈桿狀，J2細(xì)胞大小（0.4～0.8）×（0.6～1.0）μm，J3細(xì)胞大小（0.6～0.8）×（0.6～1.0）μm，F(xiàn)3細(xì)胞大小（0.6～1.0）×（0.6～1.2）μm，革蘭氏染色均為陽(yáng)性。3株拮抗細(xì)菌的部分生理生化特性見(jiàn)表2。其中，J2和J3硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)為陽(yáng)性;明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)為陰性;F3硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)為陽(yáng)性;硫化氫試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)為陰性。

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定

如圖1所示，3株拮抗細(xì)菌16S rD NA序列通過(guò)NCBI的Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rDNA 序列進(jìn)行比對(duì)，J2與解淀粉芽孢桿菌屬16S rDNA序列的相似性高達(dá)99％，初步確定其為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）;J3與芽孢桿菌16S rD NA序列的相似性高達(dá)99％，初步確定其為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）;F3與枯草芽孢桿菌屬16S rDNA序列的相似性高達(dá)99％，初步確定其為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.2 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻惡苗病的防治效果

表3所示水稻盆栽結(jié)果表明，對(duì)于只接種惡苗病菌處理，水稻葉片呈淡黃綠色且葉鞘黃色，發(fā)病指數(shù)為99%;與單加病原菌處理相比，接種拮抗細(xì)菌處理J2，J3，F(xiàn)3后，水稻發(fā)病率顯著降低（Plt;0.05），水稻葉片與葉鞘大部分為綠色，小部分發(fā)病為黃綠色，發(fā)病指數(shù)分別為31%，40%，38%，平均相對(duì)防效分別高達(dá)69%，60%，62％，但J3和F3之間差異并不顯著（Pgt;0.05），二者與J2差異顯著（Plt;0.05），表明3株拮抗細(xì)菌對(duì)水稻惡苗病防治效果較好。

2.3 拮抗細(xì)菌生防機(jī)制

2.3.1 拮抗細(xì)菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)水稻惡苗病菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，搖瓶培養(yǎng)24h后，病原菌菌絲表面光滑、圓潤(rùn)，生長(zhǎng)正常。添加10%發(fā)酵液后，各處理菌絲頂部均呈現(xiàn)部分膨大，生長(zhǎng)出現(xiàn)異常，可能與拮抗細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝酶或者某些抗菌類的物質(zhì)相關(guān)^［26-27］。

2.3.2 拮抗細(xì)菌代謝酶檢測(cè)

由表4可知，3株拮抗細(xì)菌蛋白酶、纖維素酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，蛋白酶產(chǎn)酶圈直徑分別為2，1.8，2.2cm，纖維素酶產(chǎn)酶圈直徑分別為2.5，1.6，1.7cm，表明3株拮抗細(xì)菌均能產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶，對(duì)蛋白和纖維素具有分解作用。然而，3株拮抗細(xì)菌果膠酶和幾丁質(zhì)酶試驗(yàn)均為陰性，表明均未能產(chǎn)生相應(yīng)酶降解果膠和幾丁質(zhì)。

2.4 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的影響

2.4.1 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻株高和葉綠素含量的影響

由圖3所示，與單加惡苗病菌處理相比，接種拮抗細(xì)菌J2，J3，F(xiàn)3后，水稻株高和葉綠素含量均顯著提高（Plt;0.05）。其中，水稻株高分別提高30.52%，32.25%和27.16%，但三者之間差異并不顯著（Pgt;0.05）;葉綠素含量分別提高15.7%，12.13%和9.62%，且三者之間差異顯著（Plt;0.05）。接種3株拮抗細(xì)菌對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)、葉綠素合成有明顯的促進(jìn)作用，水稻可以更好地進(jìn)行光合作用。

2.4.2 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻幼苗抗氧化酶活性和MDA含量的影響

由圖4 可知，接種拮抗細(xì)菌J2，J3，F(xiàn)3后，水稻幼苗根和葉SOD，POD，CAT活性均顯著提高，MDA含量顯著下降（Plt;0.05）。其中，水稻根部SOD活性分別提高44.45%，22.22%和35.09%，但J2和F3之間差異并不顯著（Pgt;0.05）;POD酶活性分別提高77.19%，63.03%和63.03%，但J3和F3之間差異并不顯著（Pgt;0.05）;CAT酶活性分別提高45.75%，49.13%和9.55%，但J2和J3之間差異并不顯著（Pgt;0.05）;MDA含量分別降低18.47%，20.05%和17.83%，且J3和F3之間差異顯著（Plt;0.05）。水稻葉片SOD酶活性分別提高60.51%， 61.94%和44.03%，但J2和J3之間差異并不顯著（Pgt;0.05）;POD酶活性分別提高90.70%，124.65%和89.40%，但J2和F3之間差異并不顯著（Pgt;0.05）;CAT酶活性分別提高75.01%，142.42%和75.01%，且三者之間差異顯著（Plt;0.05）;MDA含量分別降低47.35%，53.59%和52.41%，但J3和F3之間差異不顯著（Pgt;0.05）。

SOD是細(xì)胞防御系統(tǒng)中的第一道防線，能維持機(jī)體內(nèi)氧自由基的動(dòng)態(tài)平衡，可減輕氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的傷害，在細(xì)胞代謝過(guò)程中具有極其重要的地位。CAT也是清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫含量的主要酶，常與SOD聯(lián)合清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基，然后POD將SOD歧化產(chǎn)生的H₂O₂分解，三者協(xié)同作用，在細(xì)胞防御系統(tǒng)中發(fā)揮著尤為重要的作用^［28-29］。水稻幼苗經(jīng)拮抗細(xì)菌處理后，SOD，POD和CAT活性顯著提高，MDA活性下降，表明加入拮抗細(xì)菌可以有效清除氧自由基，阻礙脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA產(chǎn)生，提高水稻自身防御能力，降低病害發(fā)生。

3 討 論

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等行業(yè)^［5，30］。解淀粉芽孢桿菌對(duì)金銀花白粉病、甘蔗鞭孢堆黑粉病、稻梨孢菌、番茄灰霉病具有良好的防治作用^［31］，枯草芽孢桿菌對(duì)水稻稻瘟病^［5］、紋枯病^［32］、黃瓜枯萎病和辣椒疫霉病^［33］等植物真菌病害有不同程度的防治效果，本研究也獲得了類似的結(jié)果，表明芽孢桿菌屬的細(xì)菌對(duì)植物真菌病害具有良好的防治潛能。解淀粉芽孢桿菌可同時(shí)產(chǎn)生脂肽類和蛋白類活性物質(zhì)，可以有效抑制孢子萌發(fā)、胞內(nèi)物質(zhì)外泄等^［31］。類芽孢桿菌能夠產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等，這些酶能夠?qū)е虏≡z發(fā)生畸形，如菌絲頂端膨大、菌絲變短、彎曲、纏繞等^［20］。本研究發(fā)現(xiàn)3株拮抗細(xì)菌均對(duì)蛋白、纖維素有分解作用，說(shuō)明這些酶可以降解病原菌菌絲體細(xì)胞，導(dǎo)致菌絲發(fā)生熔斷畸變，抑制菌絲生長(zhǎng)。枯草芽孢桿菌常作為有益菌劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，可有效促進(jìn)小麥、向日葵、水稻等作物的生長(zhǎng)^［34-36］。本研究亦發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，解淀粉芽孢桿菌J2、芽孢桿菌屬J3、枯草芽孢桿菌F3可顯著降低水稻惡苗病的發(fā)病情況，防效分別高達(dá)69%，61.4%和63.4％，并能促進(jìn)植株生長(zhǎng)，株高分別提高30.52%，32.25%和27.16%。

在植物自身防御相關(guān)酶系中，POD，SOD，CAT具有協(xié)同作用，POD可以提高植物體內(nèi)SOD和CAT清除自由基和分解H₂O₂為H₂O和O₂的能力，同時(shí)，還可以阻礙脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的產(chǎn)生，防御酶的共同作用，使得植物能抵抗病害入侵和不良環(huán)境的影響^［25］。本研究中水稻幼苗經(jīng)拮抗細(xì)菌處理后，SOD，POD和CAT活性顯著提高，MDA活性下降，表明加入拮抗細(xì)菌可以提高水稻自身防御能力，降低病害發(fā)生，與張偉珍等^［37］的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

從稻蟹生態(tài)種養(yǎng)水稻根際土壤中分離得到3株對(duì)藤倉(cāng)鐮刀菌具有防控作用的拮抗細(xì)菌，經(jīng)鑒定分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），3株拮抗細(xì)菌均對(duì)水稻苗期惡苗病具有良好的防治效果，防效均在60%以上。3株拮抗細(xì)菌均可代謝產(chǎn)生蛋白酶與纖維素分解酶，并對(duì)病原菌菌絲產(chǎn)生不利影響，從而有效抑制病原菌生長(zhǎng)，降低惡苗病發(fā)病率。此外，拮抗細(xì)菌還可以誘導(dǎo)水稻SOD，POD和CAT活性提高，MDA活性下降，從而提高水稻防御能力，降低病害發(fā)生率。

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