柚皮素、柚皮苷與牛血清白蛋白相互作用的機(jī)理分析

摘 要：采用熒光光譜法對(duì)柚皮素（naringenin， NG）、柚皮苷（柚皮素-7-新橙皮苷，naringin， NA）猝滅牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）熒光發(fā)射的機(jī)理進(jìn)行了研究，并使用分子對(duì)接技術(shù)獲得了NG， NA同BSA之間的結(jié)合模型。優(yōu)化了水浴時(shí)間和溶液pH等實(shí)驗(yàn)條件，熒光測(cè)試結(jié)果顯示NG，NA濃度與BSA的熒光發(fā)射強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，并且NG猝滅BSA的程度強(qiáng)于NA。通過(guò)分析不同濃度NG， NA猝滅BSA的熒光發(fā)射可知，NG與NA猝滅BSA的機(jī)理都是靜態(tài)猝滅，即與BSA形成1∶1型非共價(jià)復(fù)合物。同步熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NG與NA對(duì)BSA的Trp殘基的影響強(qiáng)于對(duì)Tyr殘基的影響。分子對(duì)接結(jié)果表明，在BSA的Trp213殘基附近存在一個(gè)疏水性口袋，NG可以進(jìn)入其中并與BSA形成復(fù)合物，而NA則結(jié)合在BSA表面，無(wú)論NA還是NG都與BSA的多個(gè)氨基酸殘基存在氫鍵或疏水作用。

關(guān) 鍵 詞：柚皮素; 柚皮苷; 非共價(jià)復(fù)合物; 熒光光譜法; 同步熒光光譜法; 分子對(duì)接

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ460.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-5862.2023.02.003

Mechanistic analysis the binding interactions of naringenin and naringin with bovine serum albumin

YU Zhan^1，2， ZHANG Wei¹， WU Di¹， WU Yuhang¹， LIU Kefan¹， LIU Liyan¹， XIN Shigang³

（1. College of Chemistry and Chemical Engineering， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China; 2. Provincial Key Laboratory for Separation and Analysis of Complex Systems in Liaoning Universities， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China; 3. Experimental Teaching Center， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China）

Abstract：In this work， the quenching mechanism of bovine serum albumin （BSA） by naringenin （NG）， naringin （NA） were investigated by fluorescence spectroscopy and quenching types were acquired. The plausible binding models of NG and NA with BSA were obtained using the technique of molecular docking. The experimental parameters including water bath time and solution pH were optimized， respectively. The fluorescence emission data of BSA showed a trend of reciprocal proportion between quencher concentration and fluorescence emission intensity of BSA. Comparably， the quenching of NG to BSA was more tense than that of NA. Experimental results of synchronous fluorescence spectroscopy experiments indicated that NG or NA affect the Trp residues of BSA more than the Tyr residues. The molecular docking results show that there exists a hydrophobic cavity near the Trp213 residue on the surface of BSA. NG can be embedded into the cavity whereas NA is bonded to the surface of BSA. It is found that there exist multiple hydrogen bonds and hydrophobic interactions between NA or NG and BSA.

Key words：naringenin; naringin; non-covalent complex; fluorescence spectroscopy; synchronous fluorescence method; molecular docking

柚皮素（naringenin，NG）是一種黃烷酮類(lèi)化合物，NG及其糖苷廣泛存在于多種植物的果皮和果肉中^［1］。柚皮苷（柚皮素-7-新橙皮苷，naringin，NA）是最重要的一種NG糖苷^［2］。據(jù)報(bào)道，NG與NA具有多種藥理活性，并且毒性較小^［3-4］，但是它們水溶性差，通過(guò)口服被人體吸收具有一定困難，因而對(duì)這2種化合物在水溶液條件下與蛋白質(zhì)尤其是載體蛋白間相互作用的報(bào)道不多。由于NG與NA具有良好的藥物潛質(zhì)，研究NG， NA在模擬生理?xiàng)l件下與載體蛋白間的相互作用是十分必要的，這將為NG與NA的藥學(xué)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是一種分子量為66 kDa、具有α-螺旋結(jié)構(gòu)和17個(gè)二硫鍵的非糖基化球蛋白，也是激素、脂肪酸等小分子化合物的載體蛋白，是牛血液的主要成分。由于與人血清白蛋白（human serum albumin， HSA）具有高度的結(jié)構(gòu)相似性，BSA作為模式蛋白在多個(gè)領(lǐng)域受到了廣泛研究^［5］。本文通過(guò)熒光光譜法研究了NG， NA對(duì)BSA熒光發(fā)射的猝滅作用，得到NG， NA在BSA上的結(jié)合常數(shù)、位點(diǎn)等信息，并通過(guò)分子對(duì)接法獲得了BSA-NG與BSA-NA復(fù)合物可能的結(jié)構(gòu)，為NG， NA的藥物應(yīng)用及功能食品研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)^［6］。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

NG， NA（對(duì)照品，上海如吉公司）; BSA（純度≥98%）、三（羥甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris）（美國(guó)Amresco公司）; 其余試劑均為分析純或更高; 實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2MΩ·cm）。

熒光光譜儀（Cary Eclipse，美國(guó)Varian公司）;高精度恒溫水浴器（自制）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

首先配制濃度為0.1mol·L^-1， pH分別為5.4， 6.4和7.4的3份Tris緩沖溶液（含0.1mol·L^-1的NaCl）。隨后使用Tris緩沖溶液為溶劑，分別配制不同pH的BSA濃度為5.0×10^-4mol·L^-1的儲(chǔ)液。使用最少量無(wú)水乙醇分別溶解NG與NA，隨后用水分別稀釋至1.0×10^-3mol·L^-1備用。

樣品溶液配制方法如下：在若干支一次性聚丙烯離心管中準(zhǔn)確移入1.0mL的Tris緩沖溶液和20μL BSA儲(chǔ)液，然后準(zhǔn)確移取一定體積（0～30μL）的NG（或NA）儲(chǔ)液，定容至4.0mL，其中NG（或NA）濃度分別為0， 1.25×10^-6， 2.50×10^-6， 3.75×10^-6， 5.00×10^-6， 6.25×10^-6及7.50×10^-6mol·L^-1。樣品溶液經(jīng)過(guò)一定時(shí)間（10～120min）恒溫水浴后進(jìn)行熒光測(cè)試。熒光光譜儀參數(shù)如下：激發(fā)波長(zhǎng)（λ_ex）為280nm，熒光發(fā)射掃描在285～450nm;同步熒光光譜法波長(zhǎng)差分別為Δλ=15和60nm。

用于分子對(duì)接的BSA的三維結(jié)構(gòu)信息來(lái)自PDB（protein date bank）數(shù)據(jù)庫(kù)，PDB ID為4F5S。NG和NA的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來(lái)自PubChem，使用前均經(jīng)過(guò)MMFF94分子力場(chǎng)優(yōu)化^［7］。本文使用Autodock 4.2^［8］進(jìn)行分子對(duì)接，Grid設(shè)為邊長(zhǎng)是12.6nm的立方體，Grid間隔為3.75×10^-2nm。采用拉馬克遺傳算法（Lamarckian genetic algorithm，LGA）優(yōu)化對(duì)接結(jié)果，參數(shù)為ga_pop_size=150， ga_num_evals=2.5×10⁷， ga_run=100。使用LigPlot+程序^［9］分析對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 水浴時(shí)間對(duì)熒光猝滅的影響

配制5組pH為7.4、濃度為2.5×10^-6mol·L^-1的BSA樣品溶液，其中NG濃度分別為0， 1.25×10^-6， 2.50×10^-6， 3.75×10^-6， 5.00×10^-6， 6.25×10^-6和7.50×10^-6mol·L^-1。將這些樣品溶液置于310K水浴中，時(shí)間分別為10， 30， 60， 90和120min，隨后立即進(jìn)行熒光分析。當(dāng)λ_ex=280nm時(shí)，BSA的λ_{em， max}=347nm。據(jù)此波長(zhǎng)下體系熒光發(fā)射數(shù)據(jù)，計(jì)算其F₀/F（無(wú)猝滅劑時(shí)熒光劑BSA發(fā)光強(qiáng)度與加入猝滅劑NG后熒光劑發(fā)光強(qiáng)度之比），分別為1.12， 1.13， 1.15， 1.18和1.17。隨著水浴時(shí)間的增加，NG對(duì)BSA的猝滅程度越來(lái)越強(qiáng)。水浴90min時(shí)NG對(duì)BSA的猝滅達(dá)到最大。總體來(lái)看，水浴時(shí)間對(duì)NG猝滅BSA的影響較小，并且蛋白質(zhì)溶液長(zhǎng)時(shí)間置于空氣中會(huì)增加氧化的概率，因而本文選取30min作為水浴時(shí)間。

2.2 溶液pH對(duì)熒光猝滅的影響

按照2.1中主客體濃度與溶液組成，分別配制pH為5.4， 6.4及7.4的含NG（或NA）的BSA溶液，在310K下水浴30min后立刻進(jìn)行熒光分析，F(xiàn)₀/F與［Q］的關(guān)系示于圖1，其中［Q］為猝滅劑濃度。由圖1可見(jiàn)，不同pH時(shí)F₀/F對(duì)［Q］均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，但是pH可以影響NG對(duì)BSA的猝滅程度，其中pH為7.4時(shí)NG的猝滅效果最好。可能的原因是BSA在生理pH時(shí)結(jié)構(gòu)舒展、開(kāi)放，利于猝滅劑接近并產(chǎn)生相互作用。NA所得結(jié)果與NG相同。

2.3 NG， NA對(duì)BSA的猝滅作用

在水浴溫度為310K、水浴時(shí)間為30min及pH為7.4的條件下進(jìn)行NG及NA猝滅BSA實(shí)驗(yàn)，獲得如圖2所示的熒光光譜圖。隨著NG及NA的增加，BSA發(fā)生明顯的熒光猝滅，且NG猝滅能力強(qiáng)于NA。

2.4 NG， NA猝滅BSA熒光機(jī)理分析

使用Stern-Volmer公式討論NG， NA猝滅BSA的機(jī)理：

其中：τ₀是平均熒光壽命（s），生物大分子一般為10^-8s^［10］;k_q是為雙分子碰撞猝滅常數(shù);K_SV是猝滅常數(shù)。

將圖2中347nm處對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)代入式（1）擬合計(jì)算，得到如圖3所示的結(jié)果，計(jì)算可得NG的K_SV（NG）為8.2×10¹²L·（mol·s）^-1，NA的K_SV（NA）為2.6×10¹²L·（mol·s）^-1。由于這2個(gè)值都遠(yuǎn)大于大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)2.0×10¹⁰L·（mol·s）^-1［11］，所以可以確定NG，NA對(duì)BSA的猝滅機(jī)理都是靜態(tài)猝滅^［12］，即發(fā)光物與猝滅劑通過(guò)形成復(fù)合物實(shí)現(xiàn)猝滅。

當(dāng)發(fā)生靜態(tài)猝滅時(shí)，可通過(guò)雙對(duì)數(shù)曲線方程進(jìn)行分析：

其中：K_A為復(fù)合物的結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

將圖2中BSA最大發(fā)射波長(zhǎng)處強(qiáng)度數(shù)據(jù)代入式（2）擬合計(jì)算，得到如圖4所示的結(jié)果。對(duì)于NG，計(jì)算得其n為1.03，K_A（NG）為1.31×10⁵L·mol^-1;對(duì)于NA，計(jì)算得其n為1.13，K_A（NA）為1.08×10⁵L·mol^-1。由此可見(jiàn)，NG， NA都可以與BSA形成1∶1的復(fù)合物，并且NG的結(jié)合能力更強(qiáng)。

2.5 同步熒光分析

BSA之所以具有內(nèi)源性熒光是由于其含有的芳香族氨基酸，而280nm波長(zhǎng)激發(fā)BSA產(chǎn)生的熒光發(fā)射主要來(lái)自于Trp與Tyr殘基的貢獻(xiàn)，其中Trp殘基的貢獻(xiàn)大約是Tyr殘基的10倍以上^［13］。波長(zhǎng)差15nm和60nm同步熒光法可用來(lái)研究上述2種殘基對(duì)蛋白質(zhì)發(fā)光的貢獻(xiàn)。依照2.3中方法配制系列樣品溶液，進(jìn)行同步熒光測(cè)試，結(jié)果如圖5所示。

可以看出，無(wú)論何種條件下，猝滅劑的增加都會(huì)導(dǎo)致體系熒光發(fā)射下降，且伴有輕微紅移，說(shuō)明這些芳香族殘基所處的微環(huán)境極性增大，疏水性減少，表明NG和NA都可以導(dǎo)致BSA空間構(gòu)象發(fā)生一定程度的改變。通過(guò)對(duì)比圖像可以看出NG和NA的加入對(duì)Trp殘基熒光發(fā)射的猝滅能力要高于Tyr殘基，因而推測(cè)NG或NA與BSA形成復(fù)合物后，對(duì)Trp殘基的影響要大于Tyr殘基。

2.6 分子對(duì)接結(jié)果分析

分子對(duì)接可用于研究大分子對(duì)小分子的識(shí)別，并揭示可能的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。圖6（a）為得分最高的BSA-NG對(duì)接結(jié)果的三維構(gòu)象圖。BSA表面具有一個(gè)疏水口袋，并且由于NG分子形狀和極性匹配，可以進(jìn)入此空腔。圖6（b）為得分最高的BSA-NA對(duì)接結(jié)果的三維構(gòu)象圖，由圖6（b）可見(jiàn)，BSA-NA復(fù)合物同BSA-NG復(fù)合物在結(jié)構(gòu)上存在較大不同，NA結(jié)合在BSA表面而不是空腔中。推測(cè)其原因之一可能是NA分子具有體積較大的新橙皮苷，因而無(wú)法進(jìn)入BSA表面的疏水性空腔中，只能結(jié)合在表面;原因之二可能是NA的新橙皮苷部分羥基較多極性較強(qiáng)，因而與BSA表面多個(gè)極性殘基之間存在較強(qiáng)的氫鍵作用，這種作用阻止了NA進(jìn)入BSA的空腔中。

本文進(jìn)一步采用LigPlot+軟件分析了BSA-NG與BSA-NA復(fù)合物中主客體間的相互作用關(guān)系，結(jié)果示于圖7。在圖7（a）中，BSA的多個(gè)氨基酸殘基，如Val481， Gly327， Lys350， Leu480及Trp213等形成一個(gè)疏水性口袋，NG就結(jié)合在其中，并且與Trp213， Lys350及Asp323間存在多個(gè)氫鍵作用，與Val481，Leu346，Ala212等殘基間存在疏水作用。當(dāng)弱極性的NG進(jìn)入空腔后，與BSA存在疏水、氫鍵等多重作用，最終影響Trp213殘基所處環(huán)境，由此猝滅BSA的熒光發(fā)射。

從圖7（b）可以看出，NA與BSA的Arg144，His145，Ser428等多個(gè)極性氨基酸殘基之間存在氫鍵作用，還與Arg458，Leu189，Ser192等氨基酸殘基之間存在疏水作用。但由于NA結(jié)合位置距離BSA中僅有的2個(gè)Trp基團(tuán)（Trp134與Trp213）較遠(yuǎn)，因而對(duì)Trp殘基的影響有限，猝滅能力弱于NG，與熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)合理論的方法系統(tǒng)研究了NG，NA對(duì)BSA的猝滅。結(jié)果表明，NG，NA對(duì)BSA的猝滅作用符合靜態(tài)猝滅機(jī)制，其中，NG與BSA的結(jié)合常數(shù)為1.31×10⁵L·mol^-1，NA與BSA的結(jié)合常數(shù)為1.08×10⁵L·mol^-1。同步熒光法與分子對(duì)接結(jié)果揭示了NG與NA在BSA上的結(jié)合位置，NG結(jié)合在BSA的Trp213殘基附近的疏水口袋中，而NA結(jié)合在BSA分子的表面上，氫鍵與疏水作用是復(fù)合物形成的主要因素。

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