金粉蕨素抗腫瘤和抗血管內皮細胞氧化損傷的研究

吳廣,沈倩,許時麗,符平,李榮（南華大學附屬第二醫院,湖南 衡陽 421001）

惡性腫瘤的發生發展過程中，抗氧化防御系統通過產生多種促氧化酶如NAPDH酶、環氧化酶、黃嘌呤脫氫酶等發揮重要作用[1]。近年來，黃酮類化合物的抗癌和抗氧化活性是國內外研究的一大熱點，其具有抑制癌細胞生長的特性，被認為是預防癌癥和抗癌癥臨床的理想化合物[2-4]。

金粉蕨含有黃酮類化合物，金粉蕨植物中提取分離得到的一種二氫黃酮苷（flavanone glycoside）-金粉蕨素（onychin），已發現其對人結腸癌細胞、人宮頸癌細胞和人卵巢癌細胞等都表現出較好的增殖抑制活性[4-6]。本研究旨在繼續擴展其在抗癌和抗氧化等方面的藥理活性的研究。

1 材料和方法

1.1 金粉蕨素溶液的配置 以二甲基亞砜（DMSO）溶解金粉蕨素粉劑使儲存液的濃度為200mg/mL，使用0.22μm孔徑微孔濾膜過濾后，4℃避光保存，一個月內使用。使用無血清培養基稀釋至20μg/mL，并使DMSO的終濃度低于0.1%，以最高濃度組DMSO含量作為陰性對照組，12μg/mL的5-氟尿嘧啶（5-FU）作為陽性對照組。

1.2 細胞培養 MGC-803細胞、HeLa細胞和HepG2-A16細胞培養于1640培養基中，添加10%的胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，行細胞培養。

1.3 MTT法 選取處于對數生長期的腫瘤細胞MGC-803、Hela、HepG2-A16，使用0.25%的胰酶消化成單細胞懸液，1000rpm離心5min，使用含血清1640培養基重懸為密度為2.5×104個/ml的單細胞懸液，接種于96孔板，每孔加入200μl單細胞懸液。細胞貼壁過夜后加入不同濃度的含金粉蕨素培養基：0、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0μg/mL；以12μg/mL的5-FU作為陽性對照組，0.01%DMSO組作為陰性對照組。在酶標儀490nm處檢測OD值，計算各組的相對抑制率（IR）。

1.4 克隆形成實驗 取上述實驗平行處理的腫瘤細胞，在經過不同濃度的金粉蕨素處理48h后，分別用0.25%的胰酶消化成單細胞懸液，離心計數，稀釋密度500個/ml，在6孔板中每孔加入1ml單細胞懸液，輕輕晃勻，在37℃的環境下培養2-3周，直至出現肉眼可見克隆集落。終止培養，PBS漂洗兩次，加入4%多聚甲醛固定細胞30min，使用1%的結晶紫染色20min，經緩慢的流水洗去多余的染色液，室溫濾干。在顯微鏡（低倍鏡）下計數大于20個的克隆集落數，計算克隆形成率。克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%。

1.5 離體兔胸主動脈血管內皮損傷實驗 利用戊巴比妥鈉（30.0mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉新西蘭兔（南華大學實驗動物部）后，將其頸動脈放血致死。ACh誘導血管內皮舒張功能以PE收縮的舒張百分率表示。觀察ACh誘導的舒張百分比。

1.6 統計學分析 實驗數據通過SPSS19.0統計分析，數據以平均值±方差表示，組內數據經方差檢驗，組間數據采用t檢驗，P＜0.05表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 金粉蕨素抑制腫瘤細胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的增殖 由圖1可見，金粉蕨素可以顯著抑制腫瘤細胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的增殖活性，1.25μg/mL的金粉蕨素的活性抑制率分別為24%、19%、31%，相對DMSO組具有統計學意義（P＜0.05）。而不同的腫瘤細胞對金粉蕨素的敏感度還是具有顯著差異的，由圖2可見，MGC-803和HepG2-A16細胞相對HeLa細胞對金粉蕨素具有更強的敏感度。

圖1 MTT法檢測金粉蕨素對常見腫瘤細胞活性的影響

圖2 不同腫瘤細胞的耐藥性

2.2 金粉蕨素抑制腫瘤細胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的克隆形成能力 由圖3可見，金粉蕨素可以顯著抑制腫瘤細胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的克隆形成能力，2.5μg/mL的金粉蕨素的克隆形成能力分別為74.6%、47%、37%，相對DMSO組具有統計學意義（P＜0.01）。

圖3 金粉蕨素對常見腫瘤細胞克隆形成能力的影響

2.3 金粉蕨素對LPC損傷新西蘭兔離體胸主動脈血管內皮舒張功能的影響 由圖4可見，5.0μg/mL-50.0μg/mL的金粉蕨素對4.0μg/mL的LPC損傷的兔血管內皮舒張功能沒有明顯影響（P＞0.05）；而在125.0μg/mL的金粉蕨素作用下，被LPC損傷的兔血管內皮舒張功能與對照組有明顯差異（P＜0.001）。

圖4 金粉蕨素對新西蘭兔胸主動脈舒張功能的影響。注：與LPC組比較，#P＜0.05；與LPC組比較，*P＞0.05

3 討論

目前針對惡性腫瘤的治療大多數采用手術、放化療相結合的措施，治療效果不理想[7-8]。因此，尋找高效低毒的抗癌先導化合物是當務之急，也是腫瘤研發的首要任務之一。本研究發現金粉蕨素對MGC-803、HeLa和HepG2-A16細胞增殖和克隆形成能力具有抑制作用，并且呈濃度依賴性。與5-FU比較，金粉蕨素可作為先導化合物，獲得一系列衍生物，形成活性更強的抗癌化合物。

金粉蕨素作為一種新型二氫黃酮苷單體化合物[9]，能夠終止自由基的連鎖反應，從而發揮抗氧化損傷作用[10-11]。本研究用離體兔胸主動脈血管內皮損傷實驗，發現金粉蕨素對LPC損傷的新西蘭兔胸主動脈血管內皮舒張功能的作用強度與維生素E近似，保護ACh誘導的血管內皮依賴性舒張。目前的研究還僅限于體外實驗，因此金粉蕨素體內對心血管保護作用及心血管疾病防治的功能有待進一步研究。

綜上所述，金粉蕨素抗腫瘤作用已經得到初步證實，本實驗研究發現其可以顯著降低MGC-803、HeLa和HepG2-A16細胞增殖和克隆形成能力，表明了金粉蕨素單體的初步藥理方向，為傳統中藥開發腫瘤有效藥物提供了科學依據。