二十六味通經膠囊中重金屬含量測定及其安全性評價

辛青霞,昝占全,趙正峰,李欣,張金魁,切尼項毛,董海紅,祁靜靜,久美彭措1,2,△（1.青海久美藏藥藥業有限公司,青海 西寧 810000;2.青海久美藏醫院,青海 西寧 81000;.青海久美藏藥國際研究院,青海 西寧 810000;.青海省都蘭縣人民醫院,青海 都蘭 816199）

中藏藥材中重金屬含量超標的問題是現在備受熱議的話題[1-2]，現有研究表明，部分中藏藥材中重金屬含量過高，使藥材的使用存在著重大的安全隱患，是制約中藏醫藥發展并走向世界的瓶頸之一[3-4]。因國際藥品行業對中藏醫藥質量標準的要求日益嚴格，尤其是中藏藥中殘留的重金屬會影響其安全性，蓄積導致慢性中毒，重金屬進入體內主要與人體內酶蛋白上的-SH和S-S鏈牢固結合，使得蛋白質變性，酶失去活性，從而出現組織細胞結構及功能上的損害，重金屬來源可能為原藥材、輔料，提取過程中的溶媒及設備使用過程中摻雜。制訂中藏藥中重金屬元素的質量控制標準的工作是非常有必要且勢在必行。二十六味通經膠囊是青海久美藏藥藥業有限公司的一味國藥產品，其主要組成為降香、藏木香、藏茜草、訶子、紫草茸、藏紫草、朱砂、羚羊角、沙棘膏、紅花、兔耳草、余甘子、鬼臼、冬葵果、巴夏嘎、火硝、毛訶子、束花報春、硼砂、寒水石、甘青青蘭、蒺藜、山礬葉、鬼箭錦雞兒、假耬斗菜、小傘虎耳草，功能主治為平和龍血，調經活絡。用于月經不調、胸背下腹及腰疼痛，該產品療效明確，在青海以及西北地區口碑較好。

目前對二十六味通經膠囊的副作用未見報道，這對于長期服用二十六味通經膠囊的患者尤顯重要。其中膠囊組成成分中含有朱砂毒性成分，火硝、硼砂與寒水石礦物藥等，這些成分的存在使人們在使用之前會對安全性產生疑慮，為了打消使用過程中的安全顧慮，有必要對二十六味通經膠囊進行質量控制及安全性評價研究。本實驗采用原子吸收法對二十六味通經膠囊中Pb、Cd、As、Hg的含量進行測定并評價其在使用過程中安全性，為制訂二十六味通經膠囊中重金屬元素的質量控制標準及其臨床安全應用提供了一定實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 原子吸收光譜儀（型號novAA400P，德國耶拿），微波消解儀（型號TOPwave，德國耶拿），鉛、鎘、砷、汞元素的空心陰極燈（型號AS-1，北京有色金屬研究總院）；熱解涂層石墨管（德國耶拿）；乙炔氣、高純氬氣；靜音空氣壓縮機（型號HF-6100D，北京豪福機電技衍開發應用有限公司），冷卻循環水泵（型號HS-Ш，北京赫斯遠大科技有限公司）；校準合格的聚四氟乙烯容量瓶，燒杯，漏斗，針筒，針頭過濾器（0.22μm，13mm，津騰），移液管等。

1.2 試藥 鉛、鎘、砷、汞單元素標準溶液（1000μg/ml，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；硝酸、高氯酸、鹽酸、硫酸、磷酸二氫銨、硝酸鎂、硼氫化鈉、氫氧化鈉為優級純或基準物質，碘化鉀、抗壞血酸、鹽酸羥胺、高錳酸鉀為分析純，超純水等。

供試藥品二十六味通經膠囊（本廠自制，批號：20170607，20180103，20180614，20181102，20190504)。

2 方法

測定方法按照《中國藥典》第四部2321通則進行測定[5]，精密量取內標標準溶液適量，用水稀釋制成每1mL含Ge、In、Bi各1μg的混合溶液。精密量取內標準溶液適量，用5%硝酸逐級稀釋，制成濃度為1μg/mL的內標溶液。

2.1 樣品消解及供試品溶液配制 供試品溶液的配制采用微波消解法消解樣品，取供試品粉末0.5g，精密稱定，加硝酸5ml，用TOPwave消解儀執行消解及趕酸程序，用2%硝酸溶液轉移至25ml或50ml量瓶中，并稀釋至刻度（用于汞的測定，趕酸溫度設定在120℃以下，加20%硫酸溶液2ml、5%高錳酸鉀溶液0.5ml，搖勻，滴加5%鹽酸羥溶液至紫紅色恰好消失，轉入10ml量瓶中，用水洗滌容器，洗液合并于量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻），即得供試品溶液。

2.2 空白溶液的制備 空白溶液的制備每次測定必須隨行空白對照，所采用的試劑種類、用量，操作步驟與操作環境應與供試品溶液的制備相同。

2.3 儀器工作條件 原子吸收分光光度計的工作條件見表1。

表1 原子吸收儀工作條件

2.4 石墨爐升溫程序 依照干燥、灰化、原子化、除雜步驟進行，條件見表2。

表2 石墨爐升溫程序

2.5 標準溶液的制備 為方便操作，將各單元素標準溶液用2%硝酸溶液稀釋成一定濃度的標準儲備液，于低溫（0℃-5℃）保存。臨用前，取此儲備液，按要求稀釋并制備標準曲線。

分別精密量取Pb、Cd、As、Hg標準儲備液（1μg/ml）適量，用2%硝酸溶液制成每1ml分別含Pb為0、5、20、40、60、80μg/L的溶液。Cd為0、0.5、1、1.5、2μg/L；As為0、5、10、20、30μg/L；Hg為0、2、6、10、14、18μg/L的系列濃度標準溶液。

3 結果

3.1 標準曲線的繪制 按照2.3項下工作條件分別進行測定，以C（μg/L）為橫坐標，A為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，4種線性關系良好且相關系數均在0.9991（含）以上，且回收率范圍均在95%-105%，具體結果見表3。

表3 4種重金屬及有害元素的標準曲線回歸方程、線性范圍、檢測限、定量限

3.2 穩定性試驗 取二十六味通經膠囊0.5g，按“2.1”項中的方法制備供試品溶液，Pb、Cd、As、Hg測定前按照“2.5”標準曲線溶液配制，按“2.3”項下條件，于0、4、8、12、24小時測定5次，含鉛量平均值46.2mg·kg-1，RSD=1.03%；含鎘量平均值0.182mg·kg-1，RSD=2.09%；含汞量平均值3750mg·kg-1，RSD=0.99%；含砷量平均值15.98mg·kg-1，RSD=1.86%。結果表明所建立的方法穩定性良好。

3.3 精密度試驗 精密吸取已制備好的Pb、Cd、As、Hg標準溶液，分別將各元素的最高梯度濃度溶液連續測定5次，讀取吸光度值，計算得到Pb、Cd、As、Hg元素吸光值的RSD分別為1.73%、2.19%、2.55%與1.27%，結果說明儀器精密度良好。

3.4 重復性試驗 按2.3項下條件測定，取同一批號樣品，分別取樣平行測定5次，分別求得Pb、Cd、As、Hg含量的RSD為1.55%、1.71%、1.38%與1.60%，說明重復性良好。

3.5 加樣回收試驗 精密吸取適量二十六味通經膠囊置100mL錐形瓶中，并按2.3項下原子吸收分光光度計工作條件分別測定，計算回收率。

2017 年-2019年，共生產二十六味通經膠囊5批，測定留樣產品中鉛、鎘、砷和汞含量及加標回收率，結果見表4。

由表4數據可知，總鎘含量遠低于《中國藥典》中單味藥材限量0.3mg/kg，總鉛含量在50mg/kg以下，總砷含量低于20mg/kg，總汞含量相對較高，平均值為3745mg/kg。各元素單次測定加標回收率均在90%-110%，符合藥典規定。建議按照《中國藥典》2015版四部通則2321中原子吸收分光光度法測定該品種中各重金屬元素總量，并將限量定為：總鎘含量不得過0.5mg/kg，總鉛含量不得過100mg/kg，總砷含量不得過20mg/kg（與原有砷鹽限度檢查限量保持一致），總汞含量不得過5000mg/kg。

表4 5批二十六味通經膠囊重金屬元素含量及加標情況

4 討論

4.1 重金屬危害討論 重金屬對人體的新陳代謝和正常的生理功能具有明顯的傷害作用，并抑制人體正常生理作用的發揮，同時人體內重金屬含量過量會導致各種疾病的發生。重金屬危害描述：重金屬進入人體后，在體內會嚴重蓄積，從而導致一系列慢性疾病，由于現在環境污染的加重，重金屬往往暴露于人體，然后與體內有機成分結合形成金屬螯合物，機體中的蛋白質與其相結合，發生功能性損害甚至致突變、致畸[6-7]。

鉛在人體中主要損害神經系統，腎臟和造血器官。主要存在以下幾種現象：小兒發育遲緩，注意力不集中，智力低下，聽覺出現障礙等，若為慢性中毒，則導致鉛毒性腦病、急性腎功能衰竭[8]等，由于鉛的使用會使小兒智力低下，故取消了鉛的暫定每周耐受攝入量，無法設置其安全限值，鉛攝入量應盡可能低，這是由聯合國糧農組織、世界衛生組織聯合食品添加劑專家委員會（JECFA）（Provisional Tolerable Weekly Intake，PTWI）認定的[9]。

鎘致腎損傷是鎘污染對人體的主要慢性危害。一般認為鎘所致的腎損傷是不可逆的，慢性染鎘造成的腎損傷波及到整個腎臟，進入人體的鎘，主要在肝臟中誘導MT的合成并與之結合成Cd-MT。該復合物可通過血液運輸達到腎臟，經腎小球濾過后大部分被腎小管吸收，然后釋放游離的鎘，產生毒性[10]。砷主要是通過干擾酶的轉錄調控能力，從而影響各功能，伴隨的疾病主要有糖尿病、外周神經病變及高血壓等疾病，還可引起造血抑制、肝臟損傷、感覺出現紊亂及體質量減輕[11]，誘導人軟骨細胞衰老[12]。

汞主要通過呼吸道、消化道及皮膚黏膜等途徑進入人體產生危害，容易引發神經系統的功能障礙，從而造成人體頭暈頭痛等神經衰弱綜合征[13]。除此之外，汞中毒還會造成中毒性心肌炎等[14]。

從上述各重金屬元素進入人體的危害性得出，二十六味通經膠囊的安全性評價是很有必要的，從而做到公眾放心，臨床用藥安全。

4.2 方法討論 重金屬及有害元素測定方法通常采用目視法、分光光度計法、比色法。其中鉛元素測定還可采用鉛元素原子吸收法、火焰光度法、氫化物法；鎘元素還可采用火焰光度法。由于比色法在重金屬總量測定中較為常見，儀器操作簡單，但結果的準確度和選擇性較差，且受多種金屬干擾，目前石墨爐原子吸收法靈敏度已達（10-9-10-14g），可滿足多種金屬同時檢測。本實驗中采用的石墨爐原子吸收法測定二十六味通經膠囊中Pb、Cd、As、Hg含量，該方法重復性好，操作靈敏可靠、簡單，實用性強，可用于二十六味通經膠囊的質量控制。在實驗期間需要注意，為了避免在加熱過程中樣品所含重金屬損失，在對樣品處理之前，需要對溫度嚴格控制，防止其沸騰、糊化，經查閱多種關于安全性評價方法及重金屬元素的相關文獻，對于重金屬測定有多種方法，因公司經費有限，現只能采用原有原子吸收技術來測定重金屬元素含量，測得結果與藥典標準一致。本公司下一步希望通過ICP-MS儀，對原子吸收及各方法作出比較，得出更適合測定重金屬元素的方法，從而打消使用者對重金屬元素的顧慮，做到臨床安全用藥。

4.3 重金屬安全性討論 通過對二十六味通經膠囊中重金屬元素含量測定及安全性評價分析得出[15]，二十六味通經膠囊中重金屬含量均未超標，均符合《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》和《中國藥典》的規定限范圍內，限量定為：總鎘含量不得過0.5mg/kg，總鉛含量不得過100mg/kg，總砷含量不得過20mg/kg（與原有砷鹽限度檢查限量保持一致），總汞含量不得過5000mg/kg。從數據比對分析來看，二十六味通經膠囊藥用較安全，可為臨床安全用藥提供一定的理論基礎，故對本制劑中所含重金屬元素進行安全性評價研究具有重大意義。