基于網絡藥理學和分子對接技術探討麻杏石甘湯加減方治療新型冠狀病毒肺炎的機制*

劉啟平,周俊豪,張 寧,韓鵬凱△

(重慶大學附屬三峽醫院：1.呼吸與危重癥醫學科；2.全科醫學江南病區 404000)

在中國過去的5 000年歷史中記錄了300多次流行病的流行。傳統中草藥在控制這些流行病中起到了巨大的作用，挽救了許多生命。迄今為止，已開發出數百種中藥配方用于流行病疫情期間進行預防和治療。目前，新型冠狀病毒引起的傳染性肺炎嚴重威脅著人民群眾的健康。然而并沒有特定的抗病毒藥物用于治療這種突發和致命的疾病。疾病流行初期，乃至當前的治療方案主要是支持療法和非特異性療法，以減輕患者癥狀。新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在中國流行初期，我國醫院收治的患者即開始了中醫藥治療，中藥在COVID-19的治療中起到了極其重要的作用。不僅是目前的COVID-19，就是2003年傳染性非典型肺炎(SARS)流行時中醫藥也取得了良好的療效[1]。我國COVID-19診療方案明確指出，使用中醫藥治療COVID-19[2]。國家衛生健康委員會和國家中醫藥管理局聯合宣布，中藥可減輕患者發熱癥狀、糖皮質激素用量、并發癥和控制疾病進展。在各版本的COVID-19診療方案中指出，根據中醫理論，COVID-19為氣證所致，局限于肺內。其基本病機為濕、熱、毒、瘀。肺濕瘀塞癥基本處方包括麻黃草、苦杏仁、草果、連翹、蒼術、甘草等。肺毒瘀塞癥基本處方包括苦杏仁、石膏、瓜蔞、大黃、麻黃草、甘草等。肺熱癥基本處方包括麻黃、杏仁、石膏、浙貝母、甘草等。麻杏石甘湯基本處方主要為麻黃、苦杏仁、甘草、石膏等。在抗疫工作中，有學者根據患者中醫癥候在麻杏石甘湯基礎上調整用藥，利用麻杏石甘湯加減方對患者施治取得了很好的療效[3-4]。其基本藥方為生石膏、麻黃、桔梗、枇杷葉、杏仁、白術、茯苓、川貝母、黃芩、桑白皮、炙甘草等。按主證變化不同加減。但目前其作用機制尚不清楚，進一步闡明其機制有利于更深入認識疾病及更好地治療。

中藥多具有多種成分，通過多種機制協同起作用。而網絡藥理學是近年來興起的一種基于系統藥理學的研究方法，可在分子水平構建藥物與疾病的靶點網絡圖。貫穿其中的系統生物學研究與中藥多成分、多途徑、多靶點的整體系統調控不謀而合，而其整體性和系統性與中醫藥的整體觀與辨證論治相一致[5-6]。目前，已有基于此方法的多種藥物、多種疾病的相關研究[7-9]。實踐證明，該研究方法對中藥的成分、作用靶點及通路的篩選具有重要意義。本研究利用網絡數據庫對麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的作用機制進行了研究，并在此基礎上利用分子對接方法驗證了上述結果的科學性，旨在為治療COVID-19提供思路和依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

利用網絡數據庫探討麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的作用機制。

1.2 方法

1.2.1中藥活性成分及靶點基因篩選

在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫中分別輸入基本藥方中的11味中藥名稱，查找各自的有效化學成分，并依據口服生物利用度和類藥性兩個參數進行篩選目標成分，篩選條件為同時滿足口服生物利用度大于或等于30%、類藥性大于或等于0.18兩個條件，獲得麻杏石甘湯加減方的活性成分。此數據庫同樣可查詢化學成分所對應的靶點基因，故在TCMSP平臺可進一步獲得各活性成分對應的靶點。

1.2.2疾病靶點確定

在GeneCard (https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)數據庫中輸入COVID-19、2019-nCoV、novel coronavirus pneumonia等關鍵詞，查找COVID-19疾病靶點,利用韋恩圖取3個數據庫所獲得靶點的并集，然后再使用韋恩圖將麻杏石甘湯加減方活性成分靶點與COVID-19靶點比對，取其交集作為麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的靶點。

1.2.3構建成分-靶點網絡

將獲得的候選靶點通過 Uniprot (https://www.uniprot.org/)數據庫比對，確定各靶點對應基因，并結合疾病靶基因將篩選出的成分與靶點基因輸入Cytoscape 3.6.0軟件構建成分-靶點網絡。

1.2.4構建蛋白互作網絡(PPI)

將上述交集靶基因在String數據庫(https://string-db.org/)中進行檢索，篩選條件為P<0.05，獲得靶基因的相互作用網絡圖，將其中的網絡矩陣下載后導入Cytoscape 3.8軟件，使用Cytoscape 3.8軟件將結果可視化，進一步使用其中的CytoNCA插件計算核心網絡。

1.2.5基因本體(GO)富集分析

通過R軟件clusterProfiler包對靶基因進行GO功能富集分析，所得通路按P<0.05進行篩選，生物學過程、細胞定位和分子功能三類，按P值從小至大各取前10位。分析麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的可能相關功能機制。

1.2.6京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

通過R軟件clusterProfiler包對靶基因進行KEGG通路富集分析，所得通路按P<0.05進行篩選，按P值從小至大取前30位，揭示麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的相關通路。

1.2.7分子對接試驗方法

通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫下載藥物有效成分二維結構，然后使用ChemBio3D軟件生成其3D結構。再在PDB(http://www1.rcsb.org/)數據庫下載蛋白受體至3D結構文件，然后利用PyMOL軟件去除3D結構中的水分子和小分子配體結構，將上述結構轉換為PDBQT文件，并使用AutoDocktools軟件確定蛋白受體的活性口袋區域，最后使用vina軟件進行分子對接，結合能為負表示配體與受體可自發結合，以結合能小于或等于0時為受體和配體可自由結合。一般認為，配體與受體結合的構象穩定時能量越低發生的作用可能性越大，結合能小于0說明配體和受體可自發結合[10]。

2 結 果

2.1 活性成分及相應靶點

麻杏石甘湯基本藥方活性成分189種，靶點基因330個。

2.2 疾病靶點

疾病靶點393個，中藥化合物與COVID-19共同靶基因22個，即DPP4、OPRD1、腫瘤壞死因子(TNF)、HMOX1、CYP3A4、PPP3CA、GSTM1、CES1、EGFR、VEGFA、白細胞介素-6(IL-6)、POR、PLAT、CRP、MCL1、OPRK1、DRD2、GSTA2、FYN、TBK1、MAP2K1、COMT。見圖1。

圖1 麻杏石甘湯加減方與COVID-19靶點交集韋恩圖

2.3 成分-靶點網絡

藥物活性成分67個，潛在靶點22個。藥物靶基因網絡圖見圖2。

外周圓形邊緣代表藥物，長方形代表藥物有效成分，長方形代表靶基因，長方形大小代表其連接度。

2.4 PPI及核心網絡鑒定

PPI有139條邊，22個節點。核心網絡中IL-6、TNF均為連接度最高的節點。見圖3。

A：網絡圖；B：核心網絡。

2.5 生物通路富集分析

生物過程主要涉及絲氨酸調節、細胞對外源性物質的反應、細胞膜結構等，見圖4。麻杏石甘湯加減方治療COVID-19涉及的信號通路主要為Toll-like受體信號通路、T淋巴細胞受體信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒作用等與炎癥相關的通路。見圖5。通路的最終靶點之一為IL-6。見圖6。預測的靶基因中也有IL-6，二者是相符的。

圖4 GO富集分析氣泡圖

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

圖6 Toll-like受體信號通路圖

2.6 藥物成分與IL-6蛋白分子對接

IL-6是其中的核心基因，同時，IL-6也是參與COVID-19病理生理的中藥炎癥介質，所以選用IL-6作為蛋白，分析藥物有效成分與IL-6結合的能力。麻杏甘石湯加減方中活性化合物與IL-6 有較好的結合活性，槲皮素、千層紙素A、木犀草素、漢黃芩素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯與IL-6結合的自由能分別為-7.4、-7.2、-7.4、-7.0 kcal/mol。見表1。

表1 藥物成分與IL-6蛋白分子對接

3 討 論

COVID-19已形成全球大流行，在全世界引起了嚴重后果，但目前COVID-19的治療仍然是有限的，迫切需要尋找有效的治療藥物。因此，世界各地科學家均在積極探索能顯著有效抗擊COVID-19的藥物。目前，還沒有特效藥物治療COVID-19。在中國的COVID-19治療中，中藥得到了廣泛應用，并獲得了良好療效。多項研究回顧性分析了中醫藥在武漢及其他地區治療COVID-19的功效，達成了一個重要的共識，即中醫藥在病毒感染早期和治療階段均有效，并減少了COVID-19輕癥轉為重癥及入住重癥監護病房(ICU)的患者數[11-13]。中醫藥還常用于協助ICU患者接受西醫治療。如患者從ICU轉出，中醫藥在感染恢復期也顯示出了療效。

盡管中醫藥在中國已得到廣泛應用，其安全性和有效性在中國幾乎所有醫院中均得到了證實，但其機制尚不清楚。以往也有相關研究探討了麻杏石甘湯抗病毒、抗炎的相關機制。體外模型研究表明，麻杏石甘湯可直接抑制流感病毒復制，較利巴韋林具有更好的病毒吸附抑制和宿主細胞保護作用[14-15]。動物實驗表明,麻杏石甘湯能抑制小鼠感染流感病毒后機體TLR-4-MyD88-TRAF6信號通路的激活，減輕甲型流感病毒所致的肺損傷[16]。麻杏石甘湯還可改善人體免疫系統，上調IL-2、IL-4蛋白表達和分泌水平，并下調TNF蛋白表達水平治療病毒性肺炎。脂多糖(LPS)誘導大鼠急性肺損傷(ALI)模型的研究發現，麻杏石甘湯治療改善了大鼠肺微血管通透性和炎性反應，提高了LPS暴露后大鼠存活率[17]。此研究還表明，Toll樣受體4抗體(TLR-4)、非受體酪氨酸激酶(SRC)、核因子κB (NF-κB)信號通路均參與了麻杏石甘湯對ALI的治療作用。目前，對COVID-19的發病機制已有了一定的認識，有研究表明，COVID-19患者存在多種炎癥因子表達紊亂，如IL-6、TNF-α等[18]。有研究表明，IL-6與SARS患者肺部炎癥和廣泛肺組織損傷程度呈正相關[19]；IL-6由TNF、IL-1β刺激產生，檢測其外周血濃度可用于評估患者全身炎性反應強度[20]。由此可見，IL-6、TNF是COVID-19患者的臨床預警指標。同時，有研究表明，許多中藥湯劑包括麻杏石甘湯能調節細胞因子，如IL-4、IL-6、IL-10、TNF和干擾素(IFN)-γ水平[21-22]。故有理由推測，IL-6、TNF也是COVID-19的治療靶點。

目前，大型網絡數據庫的建立和藥物計算機模擬技術的發展，促進了藥理學的重大進展[23]。本研究采用網絡藥理學和分子對接技術研究麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的藥理機制及作用靶點，為臨床應用提供了理論指導和支持。通過GO富集分析可見，分子功能中主要與肽鏈的結合、氨(基)化物結合、蛋白磷酸化激酶的活性、生長因子受體的結合等有關，細胞組分中主要為細胞膜筏、膜微結構域膜區域等，生物學過程中主要與對外來化合物的反應、激素分泌、激素轉運等有關；通過 KEGG富集分析發現，主要富集在人巨細胞病毒感染、低氧誘導因子-1信號通路、Toll樣受體信號通路、T淋巴細胞受體信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、甲流病毒等重要信號通路。麻杏石甘湯加減方的治療靶點與COVID-19疾病靶點存在多方位交叉，表明藥物可通過多靶點、多通路發揮抗COVID-19的作用。也進一步說明了其治療COVID-19的通路較多，機制較復雜。但從網絡藥理學的分析中發現，IL-6是麻杏石甘湯治療COVID-19的一個靶點基因。而IL-6在COVID-19的病理過程中具有重要作用，COVID-19患者血清IL-6水平升高，隨病情好轉IL-6水平下降。本研究結果顯示，IL-6是麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的靶基因，同時，利用分子對接方法結果顯示，藥物中相關配體與IL-6結合僅需要較低自由能，可自由結合為穩定結構，從而對COVID-19達到一定的治療作用。

本研究利用分子對接方法探討了以IL-6為靶蛋白的藥物成分與之結合能力。以IL-6為靶蛋白的藥物成分為槲皮素、千層紙素A、木犀草素、漢黃芩素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯。分子對接試驗結果顯示，此4種有效成分均可與靶蛋白IL-6穩定結合。既往研究發現，槲皮素能通過抑制NF-κB和轉錄激活因子通路抑制TNF-α介導的細胞凋亡與炎性反應[24-25]。槲皮素對皰疹病毒感染機體后的增殖具有抑制作用，也可拮抗病毒誘導的細胞凋亡[26]。木犀草素對病毒具有一定的抑制作用[27]。有研究發現，千層紙素A也能起到減輕炎性反應的作用[28]。基于動物實驗的研究發現，木犀草素能顯著抑制大鼠ALI時肺組織中TNF -α、IL-10水平，從而改善肺損傷[29]。體外、體內和臨床研究均表明，木犀草素的主要藥理作用機制是其抗炎活性，其抗炎活性來源于其對轉錄因子的調控，如轉錄激活因子3、NF-κB和轉錄激活因子[30]。此外，漢黃芩素能明顯抑制流感病毒感染后肺泡巨噬細胞內各種炎癥相關因子的產生,具有抗炎作用[31]。由此可見，這4種成分不僅能與IL-6靶蛋白穩定結合，而且之前多數研究證明其具有多種抗炎作用。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學的技術手段和分子對接技術對麻杏石甘湯加減方的活性成分和靶點進行了系統性研究，闡釋了其對COVID-19的分子作用機制，突出了中藥制劑多成分、多靶標對機體整體調控的特點，為其治療COVID-19提供了理論支持。當然，目前還迫切需要進一步廣泛的研究和臨床試驗，包括有更多患者的臨床試驗及藥理學試驗，以進一步確認這些藥物的療效及機制，以便為COVID-19患者提供更好的治療方案。