30例成熟NK細胞淋巴瘤骨髓侵犯患者的臨床特點及實驗室檢查特征*

陶廷露，鄧小娟，張 云，楊武晨，張 曦，彭顯貴

(陸軍軍醫大學第二附屬醫院血液病醫學中心，重慶 400037)

自然殺傷細胞(NK細胞)是不同于T、B淋巴細胞的淋巴細胞亞群，具有細胞毒活性，能產生具有免疫調節功能的細胞因子和趨化因子。日本學者在研究NK細胞發育過程中提出了NK細胞五階段理論，其在各階段發育中克隆性增生可導致特定惡性腫瘤[1]。隨著對NK細胞發育的研究和認識的深入，2008版WHO惡性淋巴瘤分類標準中將以下4類疾病，即慢性NK細胞淋巴組織增生性疾病(cLPD-NK)、侵襲性NK細胞白血病(ANKL)、結外NK/T細胞淋巴瘤、鼻型NK/T淋巴瘤(ENKTL-NT)歸為成熟NK細胞腫瘤，并認為其發病是第4、5階段成熟NK細胞惡性克隆所致。將前體和未成熟NK細胞如髓系/NK前體細胞白血病和前體NK-淋巴母細胞淋巴瘤/白血病均歸為白血病范圍[2]。此前，由于成熟NK細胞淋巴瘤在非霍奇金淋巴瘤中發病率較低，對該疾病的認識不充分、命名繁多，導致誤、漏診率均較高。近年來，隨著流式細胞術及分子生物學等綜合診斷技術的快速發展，對成熟NK細胞淋巴瘤的認知及診斷水平均有很大提高。本研究回顧性統計了本中心收治的30例成熟NK細胞淋巴瘤患者的臨床資料，分析了其臨床特點及實驗室檢查特征，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2021年1月本中心收治的30例成熟NK細胞淋巴瘤骨髓侵犯患者的臨床資料，其中男18例，女12例；年齡14～75歲，中位年齡42歲；ANKL 8例，ENKTL-NT 16例，cLPD-NK 6例。所有患者的診斷均參照2008年WHO造血和淋巴組織腫瘤分類標準[2]。流式細胞術檢測呈CD2+、sCD3-、cCD3+、CD5-、CD56+，無T淋巴細胞抗原受體(TCR)γδ 及 TCRαβ表達，無T、B、髓系特異性標志表達，判定為存在抗原異常表達及克隆性增生的NK細胞來源的腫瘤細胞。臨床分期參照Ann-Arbor分期。所有患者均為組織病理檢查確診為NK/T淋巴瘤后經骨髓穿刺細胞形態學及流式細胞術檢測診斷為成熟NK細胞淋巴瘤骨髓侵犯病例。

1.2 方法

1.2.1骨髓細胞形態學

無菌條件下行骨髓穿刺，抽吸0.2～0.5 mL骨髓液，涂片8張備用。骨髓涂片經瑞氏-姬姆薩染液染色，在油鏡下分類計數200～500個有核細胞，并加做過氧化物酶(POX)和糖原(PAS)染色。淋巴瘤細胞占有核細胞比例5%～<20%診斷為骨髓侵犯，淋巴瘤細胞占有核細胞比例≥20%診斷為淋巴瘤細胞白血病，淋巴瘤細胞占有核細胞比例<5%診斷為疑似侵犯。參考法美英三國協作組提出的FAB形態學分型方案中關于急性淋巴細胞白血病(ALL) 分型方法及細胞分化程度(原始、幼稚、成熟)將瘤細胞形態大致分為3類：(1)小細胞成熟型，以小細胞為主，較不規則，細胞質較少，呈灰藍色，含A顆粒；核呈圓形或類圓形，染色質聚集呈小塊狀，核仁消失或留有核仁殘跡。(2)原幼細胞型，細胞體多數為中等大小，不規則，細胞質豐富，深藍色，個別含A顆粒；核型呈圓形或類圓形，染色質粗顆粒，核仁隱約可見。(3)單核細胞型，細胞體大小不一，極不規則，細胞質多少不一，呈灰藍色，A顆粒多少不定；核畸形變顯著，染色質粗細不定，核仁大而可見。

1.2.2流式細胞術

采取2 mL肝素抗凝的骨髓標本，用直接免疫標記法進行流式細胞術檢測。流式細胞儀購自美國BKM公司(型號：BC Navios)，標記的抗體有CD10、CD79b、CD19、CD20、CD22、FMC7、CD23、CD25、CD103、CD11c、sCD3、cCD3、CD5、CD2、CD16、CD56、CD57、CD1a、CD26、CD7、CD4、CD8、CD13、CD14、CD33、MPO、CD41a、CD61、CD71、CD34、CD38、CD45、HLA-DR、TdT、Kappa、Lambda等。獲取500 000個有核細胞，采用CD45/SSC/FSC設門。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 臨床特點

8例ANKL患者多數出現發熱，淋巴結腫大并伴有不同程度肝功能損害，乳酸脫氫酶(LDH)、鐵蛋白升高，5例繼發噬血細胞綜合征(HPS)；16例ENKTL-NT患者表現為發熱15例，伴有不同程度淋巴結、肝腫大10例，脾腫大8例，其臨床表現與ANKL患者極為相似。1例cLPD-NK患者有發熱，淋巴結腫大現象。ANKL患者血象多以全血細胞減少為主(6例)，ENKTL-NT患者以兩系或三系血細胞下降為主，但二者血象差異無統計學意義(P>0.05)。6例cLPD-NK患者均出現白細胞(WBC)總數增高，WBC總數較ANKL、ENKTL-NT患者均明顯增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 NK淋巴細胞瘤臨床特點

-:表示無數據。

2.2 細胞形態學

各類型成熟NK細胞淋巴瘤在骨髓中的細胞大小及形態特征表現不同，ANKL患者瘤細胞多數以原幼細胞型為主，ENKTL-NT患者瘤細胞以單核細胞型為主，原幼細胞型也可見；cLPD-NK患者以成熟小細胞型為主。見圖1～3、表2。

圖1 原幼細胞型

圖2 單核細胞型

圖3 成熟小細胞型

表2 NK淋巴細胞瘤骨髓細胞學分型情況

2.3 免疫表型

30例患者免疫表型主要為CD56、CD2、CD57、CD16、CD7、cCD3、CD26等，見表3。多數ANKL、ENKTL-NK、cLPD-NK患者CD56、CD2呈陽性，ANKL患者CD57、CD7低表達，ENKTL-NK、cLPD-NK患者CD57、CD7高表達，差異均有統計學意義(P<0.05)。1例臨床診斷ANKL患者流式免疫分型檢測到兩群細胞，A群免疫表型CD56medCD7+CD11c+cCD3+CD2+CD4-CD8-mCD3-CD94-CD161+考慮為NK T淋巴細胞，占11.11%；B群免疫表型CD34+CD117+DR+CD38+CD13+CD33+CD56bri+CD7+cCD3-cd161-CD94-為異常髓系NK前體細胞，占46.78%瘤細胞形態表現為原幼細胞型，比例占59%。1例cLPD-NK患者細胞形態可見原始及幼稚淋巴細胞占6%，大顆粒成熟淋巴細胞占46%，免疫表型CD56+CD2+CD57+cCD3-CD16+CD4-CD8-，免疫組織化學檢查Ki-67結果為35%。

表3 30例患者免疫表型

2.4 骨髓細胞學與流式細胞術診斷率

30例患者根據骨髓形態學診斷骨髓侵犯陽性15例，疑似11例，陰性4例。流式細胞學檢測診斷骨髓侵犯陽性26例，疑似3例，陰性1例。流式細胞術檢測陽性率明顯高于涂片檢測，差異有統計學意義(86.7%vs. 50.0%,P<0.05)。

3 討 論

2008年WHO標準將ANKL、ENKTL-NT、cLPD-NK均歸入成熟NK細胞腫瘤，這類疾病的發病率、分布狀況因地域和種族的不同而有所差異。與歐美國家比較，成熟NK細胞淋巴瘤發病率在包括中國的亞洲國家相對較高[3]。ENKTL-NT首發于骨髓患者的臨床表現與ANKL患者極為相似，且病情進展快，加大了臨床診斷的難度。cLPD-NK較為罕見，表現為無痛性的臨床過程，通常以WBC增多被發現，外周血NK細胞不明原因增高，>2×109/L至少6個月[4]。本研究結果顯示，cLPD-NK患者WBC總數均高于前二者，但由于NK細胞缺乏一種特征性的重排抗原受體基因，使得很難區分惡性克隆和反應性過程，因此，診斷往往被推遲，臨床鑒別診斷困難。

ANKL臨床罕見，起病急，病死率極高。本研究8例ANKL患者中7例臨床表現出發熱，5例淋巴結腫大，6例患者全血細胞減少，4例患者肝腫大，并伴有不同程度的肝功能不全，分別有7例和5例患者LDH、鐵蛋白升高，與文獻報道一致[5]。ENKTL-NT占所有非霍奇金淋巴瘤的5%～15%，多首發于鼻部及其周圍組織，以發熱為主，侵襲性強，進展快，預后較差[6-7]。本研究ENKTL-NT骨髓侵犯患者也有不同程度的肝、脾、淋巴結腫大，且多數表現為發熱，外周血常規可有不同程度的一系或多系血細胞減少，在臨床表現方面與ANKL難以鑒別。本研究統計的多數ANKL、ENKTL-NT患者EB病毒-DNA載量、LDH、鐵蛋白均升高的臨床數據可用于協助腫瘤負荷的評估，幫助指導早期ANKL、ENKTL-NT的分期及預后。TAKAHARA等[8]通過聚合酶鏈式反應測定了20例ENKTL-NT患者血清EB病毒-DNA水平，結果顯示，20例患者EB病毒-DNA均處于較高水平。隨著治療的進行EB病毒-DNA水平降低，而在復發時增加。SUZUKI等[9]和FEI等[10]也研究了ENKTL-NT患者治療前血漿EB病毒-DNA水平與幾個臨床因素的關系，結果表明，可檢測的血漿EB病毒-DNA與更高的臨床階段、B癥狀、更差的表現狀態有關，臨床分期、治療前血漿EB病毒-DNA水平是重要的預后因素。因此，ANKL、ENKTL-NT被認為是EB病毒相關淋巴瘤[11]。

本研究將30例成熟NK腫瘤細胞根據其骨髓細胞形態特征分為3種類型，ANKL骨髓侵犯以原幼細胞型為主。據文獻報道，根據免疫表型CD56的表達強度，NK細胞可分為兩種亞型，即90%的NK細胞為CD56dim/CD16bri-，另外10%的NK細胞為CD56bri-/CD16dim。后一組被認為代表了NK細胞分化的早期階段，因該組中的細胞端粒較長，并且在異基因造血干細胞移植后出現的時間早于前一組[12-13]。CD56dim/CD16dimNK細胞屬中間階段的細胞，逐漸失去增殖能力，開始表達偏后期的CD57和KIR[14]。本研究結果顯示，7例ANKL患者的異常NK細胞為CD56bri-/CD16dim和CD57陰性，提示贅生的白血病細胞存在分化失敗和凋亡障礙。而早期的NK細胞也意味著侵襲力較強，這也解釋了ANKL骨髓侵犯的細胞類型表現為原幼細胞型的說法。本研究中ENKTL-NK骨髓侵犯則以單核細胞型為主，原幼細胞型也可見；TAKAHARA等[8]回顧ENKTL-NT發展史提到，以前組織學上ENKTL-NT由血管中心性和多形性淋巴網狀浸潤組成，被稱為多形性網狀細胞增多癥，形態學上網狀細胞與變形性大的單核細胞具有相似之處，與本研究ENKTL-NT骨髓侵犯以單核細胞型為主的結果一致。cLPD-NK以成熟小細胞型為主，與楊再林等[15]提出的形態學分類結果一致。可見，3種成熟NK腫瘤的骨髓細胞形態學的細胞特點差異較大，特征明顯，可為臨床診斷與鑒別診斷及進一步檢查提供思路與方向。

有研究表明，流式細胞學對這三類疾病骨髓侵犯的陽性檢出率高于細胞形態學。但當淋巴瘤細胞骨髓侵犯比例大于5%時兩種方法的陽性檢出率較為一致。而差異主要體現在細胞形態變異性小且瘤細胞比例少的病例中，細胞形態學對瘤細胞比例少、形態特征明顯的淋巴瘤細胞的陽性檢出率較高。而流式細胞學檢測對少量的、形態變異程度不高的細胞淋巴瘤的檢測更具有優勢，其靈敏度也高，與張巧梅等[16]研究結果一致。本研究中有1例臨床診斷ANKL淋巴瘤患者流式細胞學查見兩群異常細胞群，A群免疫表型CD56medCD7+CD11c+cCD3+CD2+CD4-CD8-mCD3-CD94-CD161+考慮為NK T淋巴細胞，占11.11%；B群免疫表型CD34+CD117+DR+CD38+CD13+CD33+CD56bri+CD7+cCD3-cd161-CD94-考慮為異常髓系NK前體細胞，占46.78%；該患者細胞形態學表現為原始及幼稚淋巴細胞，占59%。國外學者將NK細胞腫瘤按其起源分為兩類五型，第一類為前體NK細胞腫瘤，包括髓系/NK前體細胞急性白血病和前體NK-淋巴母細胞白血病/淋巴瘤；第二類為成熟NK細胞腫瘤，包括ANKL、ENKTL-NT和cLPD-NK[17]。根據上述分類，該患者可劃為髓系/NK前體細胞急性白血病。而這類白血病在2008年WHO造血和淋巴組織腫瘤分類中并未分類于T/NK細胞淋巴瘤中，只是在系列不明的急性白血病章節中進行了非結論性的論述，加之該疾病臨床罕見，臨床醫師對NK細胞的發育途徑及NK細胞腫瘤診療尚未達成共識，最后診斷為ANKL。但二者需進行鑒別，髓系/NK前體細胞急性白血病起病隱匿，常以淋巴結、縱隔等部位的髓外浸潤為首發表現，最終轉化為白血病，預后較差，免疫表型強調CD34陽性，同時表達髓系/NK細胞標志[18]。ANKL雖也常見于髓外浸潤，但免疫表型除表達 CD56外，還常表達CD2、CD16，而CD34陰性，發病常與EB病毒感染有關，一般不表達髓系抗原。

本研究中1例cLPD-NK患者淋巴細胞異常增生，原始及幼稚淋巴細胞占6%，由于慢性NK細胞增多癥多數為含大顆粒的成熟淋巴細胞，免疫表型CD56+CD2+CD57+cCD3-CD16+CD4-CD8-，免疫組織化學檢查Ki-67結果為35%；結合該患者初診時伴發熱及淋巴結腫大的臨床表現，較其他cLPD-NK患者而言，疾病侵襲力較大，警示該患者應密切隨訪，觀察病情是否進展。目前國內尚未見cLPD-NK高級別轉化的文獻報道，但在國外有患者轉化為ANKL的文獻報道[19]。BARCENA等[20]采用流式細胞術對60例患者外周CD56lowNK細胞進行了大量標記物評估，通過人雄激素受體測定建立克隆性，結果顯示，與正常NK細胞比較，克隆NK細胞顯示CD7、CD11b、CD38表達降低，CD2、CD94、人類白細胞抗原(HLA)-DR水平升高，同時CD158a、CD158b、CD161殺傷相關受體表達受限，得出了CD94hi/HLA-DR+表型圖譜可用于證明是NK細胞克隆性的結論。

綜上所述，本研究將成熟NK細胞腫瘤侵犯骨髓的臨床表現及實驗室特征進行了歸納總結，證實其臨床特征和血象特點具有一定的診斷價值。而細胞形態學是發現瘤細胞簡便、快捷的手段，對分型具有一定指導意義。但僅依靠形態學檢查也不能確診，對精準診斷腫瘤類型流式細胞學的特異度及靈敏度均高于細胞形態學。而二者聯合應用能提高診斷準確性，特別是針對臨床表現較為惰性的cLPD-NK，聯合檢測才能做到早期精準診斷。所以，NK細胞克隆性的有用標記物的選擇對診斷該疾病尤為重要。當然，需要進行更多前瞻性臨床研究，檢測所有殺傷細胞免疫球蛋白樣受體亞型，并對NK細胞進行二代基因測序，以更好地了解該疾病的發病機制，更好地進行臨床靶向治療。