sh-RNA沉默HMGB1對膿毒癥小鼠肺損傷保護作用研究*

張 波，李永翔，范家偉，康 超

(山東省聊城市第二人民醫(yī)院/山東第一醫(yī)科大學附屬聊城二院急診科 252600)

目前，膿毒癥及其繼發(fā)的多器官功能障礙綜合征(MODS)是重癥監(jiān)護病房患者的主要死亡原因，全球每年發(fā)病2 000萬例，病死率為30%[1]。多年來，人們認為全身炎性反應綜合征(SIRS)是導致其高發(fā)病率和高病死率的原因，但許多抑制炎癥的臨床試驗均未能提高患者生存率[2-4]。2016年膿毒癥被重新定義為由宿主對感染的反應失調(diào)引起的MODS[5]，這將焦點從SIRS轉(zhuǎn)移到了MODS。但對膿毒癥導致器官功能障礙的機制的了解仍然非常有限[6]，因此，找到介導多器官功能障礙的機制是目前深入了解膿毒癥病理生理學的主要挑戰(zhàn)。

高遷移率族蛋白1(HMGB1)的過度表達已被證明是各種疾病中器官損傷的原因。HMGB1可有效驅(qū)動膿毒癥的炎性反應，抑制HMGB1的釋放可預防膿毒癥出現(xiàn)嚴重的多器官功能障礙，并能提高膿毒癥動物存活率[7]，已被確定為膿毒癥的重要治療靶點。本研究通過建立小鼠膿毒癥模型并通過短發(fā)夾RNA(sh-RNA)干擾HMGB1的表達，從而觀察膿毒癥小鼠模型中炎癥因子及肺損傷相關(guān)分子的表達情況，探索HMGB1在膿毒癥小鼠模型中對肺損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取6～10周齡、體重(22±2)g的健康C57BL/6小鼠作為研究對象，購自上海史萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)在特定溫度(25～27 ℃)、濕度(45～50%)下，自由進食和飲水。隨機分為磷酸鹽緩沖液(PBS)組、脂多糖(LPS)組、LPS+sh-RNA陰性對照(sh-NC)組和LPS+sh-HMGB1組。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建表達sh-RNA慢病毒載體

根據(jù)基因庫中小鼠HMGB1基因序列(NM_001313894)設(shè)計1條sh-RNA序列和1個陰性對照(NC)序列，sh-HMGB1正向:5′-TTG GTG CAC AGC ACA AAT TAG-3′，反向:5′-CTA ATT TGT GCT GTG CAC CAA-3′；sh-NC正向:5′-CAA CAA GAT GAA GAG CAC CAA-3′，反向:5′-TTG GTG CTC TTC ATC TTG TTG-3′。sh-HMGB1和sh-NC序列均由上海Sangon生物技術(shù)有限公司合成，將合成的sh-HMGB1和sh-NC序列插入質(zhì)粒載體pSIHl-H1-copGFP中，然后提取和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。

1.2.2制作小鼠膿毒癥模型

PBS組小鼠腹腔注射PBS 10 mg/kg；LPS組小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg；LPS+sh-NC組小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS、慢病毒攜載的sh-NC；LPS+sh-HMGB1組小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS、慢病毒攜載的sh-HMGB1。造模后48 h心臟采血0.2 mL，并用4%戊巴比妥100 mg/kg腹腔注射對小鼠實施安樂死，獲取肺組織。

1.2.3檢測血清前列腺素E2(PGE2)及炎性細胞因子

血液標本在室溫下保存30 min，然后3 500 r/min離心15 min(離心半徑6 cm)，分離血清。用PGE2酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測定小鼠血清PGE2水平。用ELISA試劑盒檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL-1β)、IL-6表達水平。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.2.4測定髓過氧化物酶(MPO)活性

將肺組織在PBS中研磨成勻漿。稀釋10倍后勻漿在4 ℃離心20 min，然后用1 mL冰醋酸(50 nmol/L，pH 6.0)重新懸浮，用0.5% CETOH溶液沉淀，超聲粉碎10 s。使用MPO比色活性測定試劑盒(南京建成股份有限公司)按說明書測定MPO活性，使用酶標儀在650 nm處測量樣品吸光度(A)值，根據(jù)標準曲線計算MPO活性。

1.2.5測定組織細胞凋亡

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP -生物素缺口末端標記(TUNEL)染色測定組織細胞凋亡，將石蠟包埋的肺組織切成3 μm厚的切片，二甲苯脫蠟，乙醇復水，37 ℃用蛋白酶K消化15 min，使用原位凋亡檢測試劑盒進行TUNEL檢測，嚴格按試劑盒說明書進行操作。用奧林巴斯BX53F光學顯微鏡(400×)觀察，用ImageJ軟件計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)，即為凋亡細胞數(shù)。實驗進行3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 對PGE2及炎性細胞因子的影響

LPS組小鼠PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平均明顯高于PBS組，LPS+sh-HMGB1組小鼠PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平均明顯低于LPS+sh-NC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明膿毒癥小鼠模型血清PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6高表達，而沉默HMGB1表達后PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平明顯下降。見圖1。

A：各組小鼠血清PEG2代謝產(chǎn)物水平；B：各組小鼠血清TNF-α表達水平；C：各組小鼠血清IL-1β表達水平；D：各組小鼠血清IL-6表達水平。*：P<0.05，與PBS組比較；#：P<0.05，與 LPS+ sh-NC組比較。

2.2 對肺組織MPO活性的影響

LPS組小鼠肺組織MPO活性明顯高于PBS組，LPS+sh-HMGB1組小鼠肺組織MPO活性明顯低于LPS+sh-NC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明膿毒癥小鼠模型肺組織MPO活性明顯升高，而沉默HMGB1的表達可降低MPO活性，對膿毒癥小鼠肺損傷具有保護作用。見圖2。

*：P<0.05，與PBS組比較；#：P<0.05，與LPS+sh-NC組比較。

2.3 對肺組織細胞凋亡的影響

與PBS組比較，LPS組小鼠肺組織有明顯的炎性反應，表現(xiàn)為大量中性粒細胞聚集，明顯肺水腫，肺組織凋亡細胞比例明顯升高，LPS+sh-HMGB1組小鼠肺組織中性粒細胞聚集和肺水腫較LPS+sh-NC組明顯減輕，凋亡細胞比例明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明LPS誘導的膿毒癥小鼠模型可造成肺組織病理損傷，而沉默HMGB1的表達可減輕肺損傷。見圖3、4。

*：P<0.05，與PBS組比較；#：P<0.05，與LPS+sh-NC組比較。

圖4 各組小鼠肺組織TUNEL染色情況(400×)

3 討 論

膿毒癥是一種常見的急危重癥，主要表現(xiàn)為持續(xù)性低血壓、代謝性酸中毒和SIRS[8]，可能導致多個器官損傷，甚至死亡。最近對美國6家醫(yī)院568例死亡患者進行的一項隊列調(diào)查結(jié)果顯示，膿毒癥出現(xiàn)在300例患者(52.8%)中，是198例患者(34.9%)最常見的直接死亡原因，表明膿毒癥仍然是醫(yī)院患者的主要死亡原因[9]。由于肺部易感性，急性肺損傷(ALI)是膿毒癥常見的致死性并發(fā)癥之一[10]。HMGB1是一種存在于細胞外的晚期炎癥介質(zhì)，細胞外HMGB1主要有兩種來源，即細胞主動分泌和被動釋放。當單核/巨噬細胞、組織細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等受到刺激和激活時可主動分泌HMGB1到細胞外。當細胞受到生物因素的影響而導致細胞損傷、裂解或死亡時HMGB1被動地釋放出細胞外[11]。主動分泌和被動釋放于細胞外的HMGB1可通過促進核因子κB (NF-κB)核轉(zhuǎn)位，導致炎性細胞因子釋放而誘導ALI和細胞凋亡，炎性細胞因子進一步促進HMGB1的釋放，導致一個正反饋回路而放大炎性級聯(lián)反應[12-15]。

sh-RNA作為一種選擇性基因沉默的治療策略，具有沉默效應較長和成本相對較低等優(yōu)勢，并且被證明比小干擾RNA(siRNA)更有效地下調(diào)基因表達。sh-RNA是由可以通過標準技術(shù)在實驗室中容易繁殖的質(zhì)粒或慢病毒顆粒編碼的，并且比siRNA具有更高的基因敲除和更少的脫靶效應，是一種常用的、穩(wěn)定的基因沉默策略[16-17]。本研究給LPS誘導的膿毒癥小鼠注射攜帶sh-HMGB1的慢病毒以抑制HMGB1的表達，從而觀察了HMGB1在膿毒癥中的作用。

PGE2參與了多種生物學過程，包括疼痛、發(fā)熱、炎癥、血管生成和腫瘤的發(fā)生，而在膿毒癥早期階段，TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性細胞因子通過過度激活淋巴細胞、吞噬細胞、血管內(nèi)皮細胞和刺激炎癥介質(zhì)的釋放而發(fā)揮關(guān)鍵的致病作用，從而導致組織損傷和器官功能障礙[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導的膿毒癥小鼠模型中，血清PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6等表達水平均明顯升高，而沉默HMGB1表達后PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平均明顯下降。有學者用米諾環(huán)素治療抑制膿毒癥小鼠肺組織NF-κB和Keap1的表達，從而下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的表達水平，結(jié)果顯示，對膿毒癥小鼠ALI具有保護作用[21]，本研究與其結(jié)論一致。

MPO是中性粒細胞中的一種特殊酶，反映了中性粒細胞的浸潤程度[22]。在肺組織中MPO的激活程度是肺組織炎性反應水平的指標[23]。JEONG等[24]發(fā)現(xiàn)，LPS可通過激活NF-κB (P65)和MAPK(p38，JNK，ERK)而使肺泡灌洗液中MPO、中性粒細胞浸潤、肺泡通透性及促炎性細胞因子IL-6、TNF-α水平顯著增加。與本研究結(jié)果一致，而體內(nèi)沉默HMGB1可降低肺組織中MPO活性，從而達到保護肺組織的作用。

肺上皮細胞的凋亡在膿毒癥ALI的發(fā)病機制中具有重要意義，因此，減少細胞凋亡的過度激活可能是一種重要的治療策略。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥小鼠肺組織凋亡細胞比例明顯升高，而沉默HMGB1表達后肺組織凋亡細胞比例明顯降低。TANG等[25]研究表明，HMGB1可誘導煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶激活，增加中性粒細胞中活性氧的產(chǎn)生，誘導自噬，并增加肺損傷。而包括丙酮酸乙酯在內(nèi)的抗氧化劑可減少HMGB1的釋放，減少肺損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素可顯著抑制HMGB1的表達，抑制NF-κB的激活，從而使膿毒癥小鼠肺組織細胞凋亡減少，caspase-3、裂解caspase-3和Bax表達下調(diào)，Bcl-2表達上調(diào)[26]，與本研究結(jié)論一致，提示沉默HMGB1表達可抑制肺組織細胞的凋亡，從而起到保護肺組織的作用。

綜上所述，LPS誘導的膿毒癥可刺激炎性反應，并對肺組織造成明顯的損傷。而體內(nèi)沉默HMGB1可抑制炎性反應和MPO活性，減輕肺損傷，為膿毒癥并發(fā)肺損傷的防治提供了一定的理論參考依據(jù)。