恩格列凈通過調控成纖維細胞分化改善心臟重構的研究*

周桂全，王 穎，潘文旭，胡美玲，晉 軍

(陸軍軍醫大學第二附屬醫院心血管內科，重慶 400037)

心力衰竭(簡稱心衰)是多種心血管疾病的終末階段，患者5年內死亡率高達40%～50%[1]。盡管藥物治療不斷優化，但心衰發病率仍持續上升，居高不下的住院率給醫療衛生資源帶來沉重負擔[2]。因此，正確認識心衰發病機制、尋找新的治療策略對心衰防治極為重要。病理性心臟重構是心衰發生、發展的病理基礎，心肌纖維化是其主要表現，決定著心血管疾病患者的預后。細胞外基質(ECM)過度沉積和膠原纖維增多是心肌纖維化的基本特征，過度的ECM沉積會導致心臟僵硬度增加、順應性下降，加速心衰發展[3]。成纖維細胞(CFs)是非心肌細胞中的主要成分，能通過更新ECM維持正常心臟的結構和功能[4]，當受到機械拉伸、缺氧、激素等刺激時心臟中靜止的CFs會被激活并向肌成纖維細胞(MFs)分化，大量分泌ECM和α平滑肌肌動蛋白，也稱為α-肌動蛋白2(Acta2)蛋白，是MFs的關鍵特征，主要分泌的ECM為膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ[5]。早期這種生理反應能代償心臟功能，有助于心肌細胞修復，當刺激因素持續存在時會誘導CFs向MFs過度分化，促進ECM大量沉積，導致心臟發生病理性重構，最終發生心衰[6]。鈉葡萄糖共轉運蛋白2(SGLT2)抑制劑是一種新型降糖藥物，能通過促進尿糖排泄而降低血糖，多項大型臨床研究均表明，SGLT2抑制劑不僅可降低血糖，還能顯著降低心衰患者住院率及死亡風險，并與血糖狀態無關[7]。據文獻報道，SGLT2抑制劑中的恩格列凈(EMPA)可顯著抑制糖尿病小鼠心室重構，并改善舒張功能障礙[8]。然而在非糖尿病心衰模型中關于SGLT2抑制劑對心臟纖維化重構的研究較少見，其潛在機制尚不明確。因此，本研究構建了血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和苯腎上腺素(PE)聯合誘導的小鼠心臟重構模型，觀察EMPA對心臟重構的影響并探討其可能的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

選取8周齡、無特定病原體(SPF)級雄性野生型C57BL/6J小鼠，體重22～24 g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供[許可證號:SCXK(渝)20170002]。予以隨機化分籠，常規食水飼養，環境溫度控制在22 ℃左右，濕度維持為60%～70%，每12小時進行一次晝夜循環。相關動物實驗均已獲得中國人民解放軍陸軍軍醫大學實驗動物福利倫理審查委員會批準(倫理批號:AMUWEC20212174)。

1.1.2試劑及材料

AngⅡ購自美國MCE公司，PE購自美國MCE公司，EMPA購自美國MCE公司，2004 model膠囊滲透泵購自美國Alzet公司，杜氏改良Eagle培養基(DMEM)培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司，麥胚凝集素(WGA)購自美國Sigma-Aldrich公司，青霉素、鏈霉素均購自美國Sigma-Aldrich公司，RNA Extraction Kit購自日本Takara公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit購自日本Takara公司，TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本Takara公司，天狼星紅染色試劑盒購自中國Saimike公司，乙二胺四乙酸抗原修復液購自中國Beyotime公司，聚合酶鏈反應(PCR)引物由上海生工合成。

1.1.3儀器

Vevo 2100小動物超聲成像系統購自美國VisualSonics公司,氣體麻醉裝置購自英國ASA公司,激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國Zeiss公司,7500實時熒光定量PCR系統購自美國ABI公司,VS200全玻片掃描系統購自日本Olympus公司，Nanodrop 2000超微量分光光度計購自美國Life公司，BP-98無創尾套血壓計購自中國Softron公司。

1.2 方法

1.2.1建立AngⅡ/PE心臟重構模型

在麻醉箱中用5%異氟烷快速麻醉小鼠,取俯臥位固定小鼠,用2%異氟烷連接嘴部并維持麻醉,消毒小鼠背部皮膚并用組織剪剪開,組織鑷鈍性擴開皮下筋膜，持無菌鑷將經37 ℃孵箱孵育后的AngⅡ/PE滲透泵植入皮下,用皮膚縫合釘快速閉合切口。撤去麻醉裝置,等待小鼠蘇醒后放回籠位繼續飼養。AngⅡ泵入量為2 mg·kg-1·d-1,PE泵入量為25 mg·kg-1·d-1。對照小鼠予以同樣的泵植入操作，但為等體積的生理鹽水(NS)，持續灌注4周。4周后取心臟組織進行石蠟包埋及切片。

1.2.2藥物干預及分組

EMPA給藥劑量為10 μg·g-1·d-1，DMSO作為儲存溶液，用NS稀釋。術前3 d開始以口服灌胃方式給予EMPA藥物混懸液，對照小鼠予以等量DMSO，每天1次，持續4周。分為NS+DMSO組、NS+EMPA組、AngⅡ/PE+DMSO組和AngⅡ/PE+EMPA組，每組6～7只。

1.2.3細胞培養及處理

原代心臟CFs取自野生型C57BL/6J小鼠左心室組織，在DMEM培養基(含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素)中于37 ℃孵箱(含5%二氧化碳)培養1周。隨機分組，實驗組予以轉化生長因子-β(TGF-β,10 ng/mL)刺激96 h，并予以EMPA(100 μm)或DMSO共處理，空白對照組僅予以EMPA或賦形劑處理而不添加TGF-β，分為DMSO組、EMPA組、TGF-β+DMSO組和TGF-β+EMPA組，每組4只。

1.2.4心臟功能監測

在泵植入前使用超聲評估心臟功能，術后每周監測。用1%異氟烷吸入麻醉，采集并記錄左心室超聲圖像及參數，包括左心室短軸收縮率(LVFS)、舒張末期左心室后壁厚度(LVPWd)等。

1.2.5血壓測量

灌胃3周后使用尾壓法測量小鼠血壓。小鼠尾部預加熱5 min(37 ℃)，將傳感器置于小鼠尾部前1/3處，心率維持在500次左右時記錄血壓(收縮壓、舒張壓和平均動脈壓)，重復3～5次，計算平均值。

1.2.6WGA染色

將4 μm厚的心臟石蠟切片梯度乙醇脫蠟，于100 ℃裝有枸櫞酸緩沖液高壓鍋中進行抗原修復，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后使用Alexa Fluor Cy3-WGA進行染色，室溫避光孵育30 min，抗熒光淬滅劑封片,激光共聚焦顯微鏡(200×)收集WGA染色圖像，每個視野內隨機選擇10～20個類圓形心肌細胞，于對應ZEN分析軟件(版本3.3.89.0000)計算心肌細胞橫截面積(CSA)及纖維化面積。

1.2.7天狼星紅染色

將6 μm厚的心臟組織切片梯度乙醇脫蠟，PBS清洗后于新鮮制備的染色緩沖液(含1.2%/w 苦味酸水溶液、0.1%/w Fast Green FCF 和 0.1%/w Direct Red 80 溶于PBS)中浸泡1 h(室溫)，流水沖洗并干燥。中性樹脂密封后使用全自動玻片掃描儀采集天狼星紅染色圖像，隨機選擇5個100倍放大視野，通過Image J軟件分析纖維化面積。

1.2.8實時熒光定量PCR

吸去上清液并用預冷PBS中止反應，按RNA Extraction Kit使用說明書提取總RNA，并測定濃度及純度，1 μg的mRNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，引物為起始位點，在 TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ作用下使用 ABI 7500 快速實時熒光PCR 系統進行PCR擴增。反應條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火，延伸34 s，40個循環。以36b4為內參基因，讀取循環數值，使用2-ΔΔCt方法計算目的基因表達水平。引物序列見表1。

表1 引物列表

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 心臟功能

與NS+DMSO組比較，AngⅡ/PE+DMSO組小鼠術后4周LVFS顯著降低，LVPWD明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；與AngⅡ/PE+DMSO組比較，AngⅡ/PE+EMPA組術后4周LVFS顯著增加，LVPWd顯著減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠術后4周心臟功能比較

2.2 血壓

與NS+DMSO組比較，AngⅡ/PE+DMSO組小鼠收縮壓、舒張壓、平均動脈壓均明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；AngⅡ/PE+EMPA組小鼠收縮壓、舒張壓、平均動脈壓與AngⅡ/PE+DMSO組小鼠比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組小鼠血壓比較

2.3 CSA

與NS+DMSO組比較，AngⅡ/PE+DMSO小鼠CSA明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與AngⅡ/PE+DMSO組比較，AngⅡ/PE+EMPA組小鼠CSA明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 各組小鼠CSA比較

圖2 各組小鼠CSA比較(WGA染色，200×)

2.4 纖維化面積

與NS+DMSO組比較，AngⅡ/PE+DMSO組小鼠纖維化面積明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)；AngⅡ/PE+EMPA組小鼠纖維化面積較AngⅡ/PE+DMSO組明顯降低，差異統計學意義(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組小鼠纖維化面積比較

圖3 各組小鼠纖維化面積比較(WGA染色，100×)

2.5 CFs中Postn、Acta2、Ctgf mRNA水平

與DMSO組比較，TGF-β+DMSO組CFs中Postn、Acta2、Ctgf mRNA表達水平均明顯增高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與TGF-β+DMSO組比較，TGF-β+EMPA組CFs中Postn、Acta2、Ctgf mRNA表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組CFs中Postn、Acta2、Ctgf mRNA表達水平比較

3 討 論

心臟重構被認為是一個動態的病理生理過程，涉及多種復雜因素的協同作用，CFs向MFs過度分化會加劇ECM沉積，導致病理性心臟重構[9]。EMPA是一種高選擇性SGLT2抑制劑。PACKER等[10]近期進行的EMPERO-REDUCED隨機對照研究結果顯示，與安慰劑組比較，接受EMPA治療患者心血管死亡風險和心衰住院率降低了25%，且與血糖狀態無關。然而由于SGLT2在心肌中幾乎不表達，多種機制學說尚不能完全解釋其心血管保護作用，其潛在機制有待于進一步研究[11]。因此，本研究分析了EMPA對AngⅡ/PE模型小鼠心臟重構的影響，并探索了其可能的潛在機制。

AngⅡ/PE長期慢性輸注能模擬神經體液激活后的慢性高血壓，引起心臟后負荷增加，刺激心肌肥大和心肌纖維化，是一種常用的心臟重構模型[12]。本研究結果顯示，與AngⅡ/PE+DMSO組比較，經EMPA連續干預4周后AngⅡ/PE小鼠LVFS顯著增加，心肌纖維化水平、CSA、LVPWd顯著降低，而血壓無顯著變化，與先前的研究結果一致，提示EMPA可改善AngⅡ/PE誘導的心臟重構，可能與TGF-β/Smad信號通路有關[13]。

TGF-β是一種多功能細胞因子，具有多種亞型，心臟組織中主要為TGF-β1，TGF-β1及其調控的下游smad信號傳導對促進CFs分化和ECM生成具有重要作用[14]。當壓力負荷過重時TGF-β級聯反應可被激活，早期有助于形成保護型ECM，阻止有害的促ECM片段產生。然而持續過度活躍的TGF-β信號傳導可誘導CFs激活，發生病理性增生，并向以表達Acta2為特征的MFs分化[15]。MFs因產生ECM的能力遠大于CFs，是導致心肌纖維化過程中ECM過量沉積的重要細胞[16]。并且MFs具備較強的遷移和增殖能力，有助于ECM間交聯，促進膠原過度沉積，導致心肌纖維化和心功能障礙，甚至心臟傳導異常[17]。在體外使用TGF-β刺激CFs，EMPA共處理可顯著降低Postn、ACTA2、Ctgf mRNA表達，尤其是Acta2，ACTA2蛋白是區別CFs和MFs的關鍵因素，也是MFs收縮力的主要來源[18]。此外，Postn基因調控、CTGF皆是ECM重要的組成成分，Postn可直接與膠原蛋白Ⅰ相互作用并調節原纖維直徑；CTGF能精細調節ECM微環境，過量表達可誘導膠原蛋白合成增加，加劇ECM沉積[19-20]。提示EMPA能抑制TGF-β誘導的CFs向MFs分化，減少ECM沉積。

綜上所述，EMPA可能通過調控TGF-β誘導的心臟CFs向MFs過度分化，減少ECM沉積和心肌纖維化，進而改善AngⅡ/PE誘導的心臟重構，為SGLT2抑制劑改善心衰預后提供理論依據，對心衰防治具有積極影響；但EMPA對CFs分化的具體調控機制尚不清楚，有待于進一步研究。