CMTM6和PD-L1蛋白在乳腺癌組織中的表達及其對臨床病理特征和預后的影響

馬曉艷，劉姍姍，李軒飛，王衛杰

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是全球女性癌癥死亡的主要原因。盡管局部手術、常規化療、精準放療、內分泌治療和單克隆抗體的應用對乳腺癌患者的預后有顯著的益處，但仍有大量患者面臨復發和死亡的威脅。乳腺癌的預后預測與臨床分期、病理類型和分子特征有關[1-2]。因此，識別新的預后標志物對降低復發率和死亡率有一定幫助。

程序性死亡[蛋白]配體-1(programmed deathligand-1，PD-L1)是程序性死亡[蛋白]1(programmed death-1，PD-1)受體的配體，PD-L1與PD-1的結合可導致腫瘤免疫逃逸[3-4]。迄今為止，阻斷PD-1和PD-L1之間相互作用的免疫檢查點抑制劑已被用于治療多種類型的轉移性癌癥[5-6]。在原發性乳腺癌中，PD-L1的表達具有異質性，并且與更高的組織學分級和更具侵襲性的分子亞型相關[7]。最近，趨化因子樣Marvel跨膜結構域6(chemokine-like factor-like Marvel transmembrane domain-containing family member 6，CMTM6)被確定為PD-L1蛋白表達的關鍵調節因子，參與調節腫瘤免疫應答[8-9]。CMTM6的功能障礙會抑制PD-L1在許多類型腫瘤中的表達[10-12]。研究表明，引發免疫反應并加強免疫監視的治療靶標在腫瘤治療中具有潛在價值[13]。然而，CMTM6在乳腺癌中的作用仍不清楚。本研究通過收集乳腺癌組織，采用免疫組織化學方法檢測乳腺癌組織中CMTM6和PD-L1表達，并分析與患者臨床病理特征和預后的影響，探討CMTM6與PD-L1可能的關系以及是否有望成為預測乳腺癌預后的生物標記物。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2017年6月—2019年1月接受乳腺癌根治術的原發性乳腺癌患者88例，年齡(52.3±10.4)歲(29～62歲)。納入標準：(1)組織病理學確診為乳腺癌；(2)術前未接受放化療；(3)首次確診為乳腺癌。排除標準：(1)合并其他腫瘤；(2)預計生存期低于6個月；(3)合并嚴重肝腎功能障礙；(4)遠處轉移及特殊類型的乳腺癌，如炎性肉瘤、乳腺癌、黏液癌、微乳頭狀癌、小管癌、髓樣癌等。本研究經醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人CMTM6單克隆抗體(編號：90329)、兔抗人PD-L1單克隆抗體(編號：86463)、辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔單克隆抗體(編號：5127)均購于美國CST公司。免疫組織化學試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。萊卡光學顯微鏡(DM500，德國萊卡相機有限公司)。

1.2.2 免疫組織化學檢測乳腺癌組織CMTM6和PD-L1的表達 收集患者的乳腺癌組織及癌旁組織標本，進行石蠟包埋，制成4 μm厚度的病理切片。經脫蠟和梯度乙醇水化后，加抗原修復液，放置微波爐中，98 ℃ 20 min，然后自然冷卻和水洗。經封閉后，滴加anti-CMTM6或anti-PD-L1抗體(1∶200)，置于4 ℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗，滴加相應種屬二抗(1∶400)，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3遍。滴加新鮮配制的顯色液，蘇木精復染，中性樹膠封固，置于顯微鏡下觀察。

結果判定：由兩位病理科醫師在雙盲條件下進行判讀，每張切片隨機選擇5個高倍視野在光學顯微鏡下觀察。CMTM6和PD-L1均表達于細胞膜上。染色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色細胞所占百分比：陰性為0分，陽性數≤10%為1分，10%<陽性數≤50%為2分，50%<陽性數≤75%為3分，>75%為 4分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積按照 12分陽性等級：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12 分為強陽性(+++)。

1.2.3 術后隨訪 以電話和來院復查的方式進行隨訪，以手術時間為隨訪起點，以患者死亡或隨訪時間結束為隨訪終點，隨訪時間最短8個月，最長36個月。

1.2.4 觀察指標 比較乳腺癌組織和癌旁組織中CMTM6和PD-L1表達的差異，并分析其對乳腺癌臨床病理參數的影響。比較CMTM6和PD-L1不同表達組間術后3 a生存率，分析影響患者預后的危險因素，以及CMTM6陽性、PD-L1陽性和CMTM6、PD-L1雙陽性對預后不良的預測價值。

2 結 果

2.1 CMTM6和PD-L1在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達 CMTM6在乳腺癌組織中的陽性表達率為51.1%(45/88)，高于癌旁組織的6.8%(6/88)(χ2=41.992，P<0.001)。PD-L1在乳腺癌組織中的陽性表達率為70.5%(62/88)，高于癌旁組織的9.1%(8/88)(χ2=69.167，P<0.001，圖1，表1)。

圖1 CMTM6和PD-L1在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達

表1 CMTM6和PD-L1在乳腺癌組織和癌旁組織中的陽性表達率比較

2.2 乳腺癌中CMTM6和PD-L1陽性表達對患者臨床病理特征的影響 CMTM6陽性表達和PD-L1陽性表達與乳腺癌的分子分型、組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、脈管侵犯有關。在分子分型中，三陰性乳腺癌的CMTM6和PD-L1陽性表達率均高于Luminal A型和Luminal B型(表2)。

表2 乳腺癌中CMTM6和PD-L1陽性表達對患者臨床病理特征的影響

2.3 CMTM6和PD-L1不同表達組間術后3 a生存率的比較 CMTM6陽性組術后3 a生存率為55.6%(25/45)，低于CMTM6陰性組的88.4%(38/43)(χ2=11.643，P=0.001)。PD-L1陽性組術后3 a生存率為62.9%(39/62)，低于PD-L1陰性組的92.3%(24/26)(χ2=7.787，P=0.005)。CMTM6、PD-L1雙陽性組、單陽性組和雙陰性組的生存率分別為39.3%(11/28)、86.3%(44/51)和88.9%(8/9)，組間比較差別有統計學意義(χ2=21.098，P<0.001)，其中CMTM6、PD-L1雙陽性組的生存率最低(圖2)。

A：CMTM6陽性與陰性患者比較；B：PD-L1陽性與陰性患者比較；C：CMTM6、PD-L1雙陽性、單陽性和雙陰性患者比較。

2.4 影響乳腺癌患者術后3 a生存率的危險因素分析 賦值如下：年齡(<50歲為0，≥50歲為1)、分子分型(Luminal A型為0，Luminal B型為1，三陰性為2，HER-2陽性為3)、組織分化程度(高分化為0，中低分化為1)、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期為0，Ⅲ期為1)、腫瘤最大直徑(<2 cm為0，≥2 cm為1)、淋巴結轉移(無為0，有為1)、脈管侵襲(無為0，有為1)、CMTM6(陰性為0，陽性為1)、PD-L1(陰性為0，陽性為1)、CMTM6和PD-L1(雙陰性為0，單陽性為1，雙陽性為2)。經Cox單因素回歸分析顯示，三陰性乳腺癌、組織分化程度、TNM分期、脈管侵犯、CMTM6陽性、PD-L1陽性和CMTM6、PD-L1雙陽性為乳腺癌患者術后3 a生存率的影響因素。以上因素經Cox多因素回歸分析顯示，三陰性乳腺癌、中低分化程度、TNM分期Ⅲ期、CMTM6陽性、PD-L1陽性和CMTM6、PD-L1雙陽性為影響乳腺癌患者術后3 a生存率的獨立危險因素(表3)。

表3 影響乳腺癌患者術后3 a生存率的危險因素分析

2.5 CMTM6陽性、PD-L1陽性和 CMTM6、PD-L1 雙陽性對乳腺癌術后3 a死亡的預測 CMTM6(+)PD-L1(-)預測乳腺癌術后3 a死亡的曲線下面積為0.815，95%CI為0.824～0.836，敏感度為0.783，特異度為0.765。CMTM6(-)PD-L1(+)預測乳腺癌術后3 a死亡的曲線下面積為0.754，95%CI為0.740～0.769，敏感度為0.694，特異度為0.713。CMTM6(+)PD-L1(+)預測乳腺癌術后3 a死亡的曲線下面積為0.956，95%CI為0.947～0.968，敏感度為0.915，特異度為0.803，臨床價值高于CMTM6(+)PD-L1(-)和CMTM6(-)PD-L1(+)(Z=3.215、4.521，P=0.024、0.006,圖3)。

圖3 CMTM6(+)PD-L1(-)、CMTM6(-)PD-L1(+)和CMTM6(+)PD-L1(+)對乳腺癌術后3 a死亡的預測價值

3 討 論

乳腺癌是全球女性中第二大流行的癌癥，手術切除聯合輔助治療是乳腺癌最有效的治愈性方法，由于復發和遠處轉移造成的不良預后，仍需進一步的了解。部分乳腺癌患者可通過阻斷PD-1和PD-L1 之間的相互作用來抑制T細胞免疫反應而受益[14-15]。然而部分患者對PD-1/PD-L1抑制劑沒有反應，部分初始有反應的患者隨著時間的推移會產生耐藥性[16]。PD-L1在腫瘤細胞或腫瘤浸潤免疫細胞上的表達，不能準確預測患者對PD-1/PD-L1抑制劑的反應。因此，對PD-L1表達的分子調控認識是有限的。目前多項研究顯示，CMTM6對PD-L1 有調節作用，但CMTM6在乳腺癌中的表達水平及對患者預后的影響尚不明確。

CMTM6促進腫瘤細胞中PD-L1的表達以防御T細胞的殺傷作用，相比之下，CMTM6的消耗可緩解T細胞免疫抑制作用[17]。此外，據報道頭頸部鱗狀細胞癌中CMTM6升高與預后不良相關[18]，并且是腎透明細胞癌的潛在治療靶點[19]。CMTM6和PD-L1雙陽性表達可作為肺癌的預后和治療指標[11,20]。本研究中，乳腺癌組織中CMTM6和PD-L1 的陽性表達率高于癌旁組織，且兩者的陽性表達與乳腺癌的惡性及侵襲性相關，例如中低分化的腫瘤組織、TNM分期Ⅲ期及淋巴結轉移和脈管侵犯。一項包含619例肝細胞癌的隊列研究顯示，CMTM6表達升高經常伴隨更嚴重的惡性現象，例如TNM分期晚期、血管侵犯等[20]。本研究結果與此研究結果相一致。此外，本研究還顯示，三陰性乳腺癌中CMTM6陽性表達率和PD-L1陽性表達率明顯高于Luminal A型和Luminal B型乳腺癌，提示其可能與患者的不良預后相關。

CMTM6和PD-L1雙陽性表達組患者術后3 a生存率僅為39.3%，提示雙陽性表達是乳腺癌患者預后不良因素。LIU等[20]研究顯示，CMTM6和PD-L1的共表達為巨大肝細胞癌預后不良的預測因子。在非小細胞肺癌的免疫組織化學和mRNA表達數據中，CMTM6表達與PD-L1呈正相關[11-12]。阻止CMTM6與PD-L1結合可能會恢復現有的免疫抑制反應，并有希望成為免疫治療的一個靶點。在肺癌的基質細胞中，CMTM6和PD-L1共表達的患者行免疫治療后與非免疫治療者相比具有更長的總生存期[9]。經受試者工作曲線顯示，CMTM6和PD-L1雙陽性對乳腺癌術后3 a不良預后的預測價值高于單陽性組，提示CMTM6和PD-L1之間可能存在某種關系，共同促進乳腺癌的惡性進展。研究顯示，CMTM6維持PD-L1細胞表面表達的穩定性，并在PD-L1的存活中起關鍵作用[18]。CMTM6不是PD-L1成熟所必需的，而是與PD-L1共定位于質膜和循環內體中，可以防止PD-L1成為溶酶體介導的降解的目標[17]。因此，降低CMTM6水平對PD-L1抑制劑的抗乳腺癌治療應該有一定的幫助。

綜上所述，CMTM6和PD-L1在乳腺癌中的陽性表達率增加，影響乳腺癌患者術后3 a的生存率，雙陽性對乳腺癌患者術后預后不良具有較強的臨床預測價值。CMTM6靶向治療有望成為增強PD-L1抑制劑抗腫瘤的方案之一。