GeXP多重PCR技術對老年呼吸道感染患者常見呼吸道病毒的檢測及病毒流行特征分析

曾勇軍，黃歡歡，歐陽雨晴，曾勇彬

呼吸道病毒是通過呼吸道傳播、在呼吸道黏膜上皮細胞中增殖、導致呼吸道感染或呼吸道以外組織病變的一類病毒。老年人由于年齡增長，生理及免疫功能減退，再加上各種基礎性疾病，出現呼吸道病毒感染(respiratory tract infection, RTI)的機會和死亡率均比年輕人群高[1-2]。呼吸道感染可由細菌、支原體、衣原體和病毒等病原體引起，其中常見的病毒有流感病毒(influenza virus, IFV)、副流感病毒(human parainfluenza virus, HPIV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)和人鼻病毒(human rhinovirus, HRV)等[3]。由于不同病毒感染的臨床癥狀和體征較為相似，因此，及時、準確檢測和鑒別呼吸道病毒對輔助臨床醫生的診斷和治療具有重要意義。

目前，RTI的檢測方法包括病毒培養、免疫學技術、PCR技術等[4]。病毒培養是“金標準”，但該方法操作步驟復雜、耗時耗力、對技術、設備要求高，不適宜在臨床實驗室應用；免疫學技術相對簡單，但病毒感染至少6 d才可產生IgM抗體，患者既往感染產生的抗體可導致檢測出現假陽性，其檢測敏感度和特異性仍有待提高；PCR方法對病毒檢測靈敏、特異，但一般情況下常規PCR 1次反應只能檢測到1～3種病毒，通量較低。對于老年患者而言，由于呼吸道病原體診斷不明確、不及時，臨床醫生多采用經驗性治療，易導致藥物的不科學使用及治療的延誤。因此，尋找一種準確、快速、通量大、靈敏度高、特異性強的呼吸道病毒檢測方法尤為重要。

GenomeLab GeXP多重基因表達遺傳分析系統是一種新的基因表達譜分析平臺，能在一個反應中對多達30種靶基因進行分析，巧妙地將多重 PCR技術和毛細管電泳技術結合，采用通用引物與特異引物相結合的方法實現多重、靈敏、特異、快捷檢測的目的[4-5]。筆者采用GeXP多重PCR技術檢測11種呼吸道病毒核酸，包括甲型流感病毒(influenza A virus, IFVA)、甲型流感病毒H1N1(influenza A virus H1N1, H1N1)、甲型流感病毒H3N2(influenza A virus H3N2, H3N2)、乙型流感病毒(influenza B virus, IFVB)、腺病毒(human adenovirus, HADV)、博卡病毒(bocavirus, BOCA)、HRV、HPIV、冠狀病毒(human coronavirus, HCOV)、RSV、偏肺病毒(human metapneumovirus, HMPV)等，探討其應用價值，并進一步分析老年呼吸道感染患者呼吸道病毒的流行特征，為臨床診治提供幫助。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2020年1月—2021年12月就診筆者醫院年齡、性別相匹配的老年(≥60歲)呼吸道感染患者。納入標準：呼吸道感染診斷標準參照《內科學》(第9版)相關標準[6]。上呼吸道感染的診斷標準：(1)包括普通感冒、急性病毒性咽炎和喉炎、急性皰疹性咽峽炎、急性咽扁桃體炎相關病史；(2)典型癥狀如發熱、頭痛、鼻塞、咽痛等表現；(3)胸部X射線檢查陰性。下呼吸道感染的診斷標準：(1)包括急/慢性支氣管炎、氣管-支氣管炎、肺炎、支氣管肺炎、支氣管擴張相關病史；(2)咳嗽、咳痰等癥狀；(3)肺部出現干、濕啰音；(4)X射線胸片多為肺紋理增強。排除標準：入院前已使用抗生素、抗病毒藥物等。本研究經筆者醫院倫理委員會批準(閩醫大附一倫理醫技審[2015]084-1)，患者均知情同意。

1.2 試劑與儀器 病毒核酸提取試劑盒(寧波市重鼎生物技術有限公司)、呼吸道病原體多重檢測試劑盒(寧波海爾施基因科技股份有限公司)、GenomeLab GeXP遺傳分析系統及毛細管電泳相關試劑(如DNA標準分子片段-400、礦物油、分離膠等)(美國貝克曼庫爾特有限公司)、PCR擴增儀(美國Life Technologies公司)。

1.3 標本采集和核酸提取 按照《全國臨床檢驗操作規程(第4版)》[7]留取患者標本(鼻咽拭子、痰、支氣管肺泡灌洗液)及判斷標本留取質量。痰液標本：平均每低倍鏡視野鱗狀上皮細胞數<10個；肺泡灌洗液：鱗狀上皮細胞數<細胞數的1%。采用商品化病毒核酸提取試劑盒提取標本中的核酸。

1.4 核酸擴增 病毒的核酸擴增包括逆轉錄反應和PCR反應。逆轉錄反應條件為：(1)25 ℃退火5 min。(2)50 ℃逆轉錄15 min。(3)95 ℃滅活逆轉錄酶2 min。PCR反應條件為：(1)94 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，重復6個循環。(2)94 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，重復29個循環。(3)72 ℃ 10 min。(4)反應產物4 ℃ 保存。

1.5 GeXP平臺檢測 (1)制備電泳樣品。上樣緩沖液28.7 μL，標準分子片段(SizeStandard-400)0.3 μL，PCR產物1 μL，礦物油1滴。(2)準備分離液。將200 μL分離液加入96孔板上適當數目的孔中。(3)利用GeXP多重基因遺傳分析系統毛細電泳分離樣品。

2 結 果

2.1 一般情況 共納入老年呼吸道感染患者694例，其中男性496例，女性198例，其人口統計學特征見表1。本研究所測標本的總體陽性率為14.99%(104/694)，不同種類病毒陽性檢出率差別有統計學意義(χ2=156.26，P=0.00)，最常見的病毒為HRV(6.05%，42/694)；其次為HADV(3.60%，25/694)和IFVA(2.31%，16/694)；其他病毒為HCOV(1.44%，10/694)、H1N1(1.15%，8/694)、HRSV(0.86%，6/694)、IFVB(0.58%，4/694)、HMPV(0.58%，4/694)和HPIV(0.29%，2/694)。呼吸道病毒在不同性別、不同呼吸道感染部位及不同標本類型的檢出率差別均無統計學意義(表1)。

表1 694例老年呼吸道感染患者人口統計學信息及病毒總體檢測情況

2.2 GeXP多重PCR技術檢測結果的確認 分別采用無RNA酶水和攜帶相應病毒核酸的質粒作為無模板對照(no-template control, NTC)和陽性對照(positive control, PC)。在NTC中只出現人DNA內參(huDNA)峰和RT-PCR內參(internal control, IC)峰，且2個內參峰的峰高均高于標準品峰高，未觀察到除內部參考外的峰；在PC中出現11個病毒峰，且病毒峰區分良好，高度均高于標準品峰高度，表明GeXP多重PCR技術的檢測結果準確可靠(圖1)。

A：無模板對照；B：陽性對照。

2.3 單一病毒檢出陽性率與混合病毒檢出陽性率情況 檢出單一病毒91例(13.11%，91/694)，占陽性標本的87.50%(91/104)；檢出混合病毒13例(1.87%，13/694)，占陽性標本的12.50%(13/104)。單一病毒檢出率高于混合病毒檢出率(87.50%vs12.50%，χ2=117.00，P<0.001)。混合病毒檢出主要是IFVA與其他病毒的共同檢出，占混合病毒檢出的61.54%(8/13)，其中IFVA與H1N1合并檢出占混合病毒檢出的46.15%(6/13)(表2)。

表2 老年呼吸道感染患者單一病毒檢出陽性率與混合病毒檢出陽性率情況

2.4 不同年齡組呼吸道病毒檢出陽性率情況 將老年呼吸道感染患者按年齡分成3組：60～69歲組、70～79歲組、≥80歲組。≥80歲組陽性檢出率最高(21.62%，40/185)，其次是70～79歲組(陽性檢出率15.92%，39/245)和60～69歲組(陽性檢出率14.39%，38/264)。不同年齡組病毒檢出陽性率比較，差別無統計學意義(χ2=4.29，P=0.12，表3)。

表3 不同年齡組呼吸道病毒檢出陽性率分布情況

2.5 不同季節呼吸道病毒檢測情況 根據季節分為4組：春季(3—5月)147例，夏季(6—8月)216例，秋季(9—11月)182例，冬季(12、1、2月)149例。不同季節病毒檢出情況見表4。總體而言，在春、冬季病毒檢出陽性率較高，分別為29.25%(43/147)和20.13%(30/149)。病毒在冬、春季節的檢出陽性率更高(χ2=28.04，P<0.001)。不同病毒檢出情況各不相同，H1N1、HMPV有明顯的季節分布特征，冬季和春季均有較高的檢出率。HRV、HADV多為散發，四季均有檢出，無明顯季節差別。

表4 不同季節呼吸道病毒檢出陽性率分布情況

3 討 論

RTI是引起老年患者死亡的原因之一，給家庭和社會帶來較大的醫療負擔[2]。快速、準確、高通量檢測老年人呼吸道感染的病原體，了解其流行特征，對老年人呼吸道感染的預防和治療具有重要的意義。GeXP多重基因表達遺傳分析系統是將毛細管電泳分離技術、多重PCR技術和熒光標記相結合的一種檢測分析系統。與普通PCR技術相比，該技術具有快速、靈敏、高通量等優勢，已應用于呼吸道感染性病原體的檢測[4, 8]。本研究中采用的GeXP多重PCR技術能在4 h內完成13種呼吸道病原體(包括11種病毒、肺炎支原體和肺炎衣原體)的檢測，可幫助臨床醫生及時地進行呼吸道感染的早期干預。

本研究中，呼吸道病毒檢測陽性率為14.99%，與魏菁菁等[9]的報道類似，但低于前期(2020年之前)上海、河北等地區的研究[10-11]，可能的原因之一是，隨著新型冠狀病毒肺炎的流行，人們加強自我防護意識，如戴口罩、保持適當的社交距離、減少聚集等，從而減少了呼吸道病毒的傳播，降低了呼吸道病毒檢測的陽性率。研究[12]表明，老年人感染HRV的風險是年輕人的10倍，感染IFV的風險是年輕人的5倍。本研究中，老年呼吸道感染患者病毒感染陽性率檢出最高的是HRV，其次是INFA和HADV，與其他報道[13]一致，且男女之間的病毒檢出陽性率無明顯區別。

通過年齡分組分析發現，呼吸道病毒的檢出率隨著年齡的增加而增加，≥80歲組檢出率最高，與文獻[10]報道一致，可能的原因是隨著年齡的增長，老年人患基礎性疾病的概率增加，免疫力下降，從而增加了患呼吸道感染的風險。呼吸道感染可存在多種混合感染，一種病毒可引起多種臨床癥狀，一種癥狀也可由多種病毒引起。在本研究中，混合感染13例，陽性率為1.87%，占陽性標本的12.50%；其中INFA與H1N1合并感染最多，與其他研究[11]有所差別，可能是由于不同地區病毒感染的流行情況不一所導致。RTI具有明顯的季節性差別，本研究呼吸道病毒在春、冬季節的檢出率明顯高于夏、秋季節，考慮氣候變化是導致病毒檢出率呈季節性變化的重要因素，寒冷天氣易引起鼻黏膜血管收縮，降低抵抗力；另外寒冷天氣老年人戶外活動顯著減少，室內聚集增加，空氣不流通，從而增加呼吸道感染的風險。IFV包括IFVA、H1N1、IFVB、H3N2，是引起老年人RTI死亡的一個重要原因，并且通常發生在冬、春季[14]。在本研究中，IFV是第二常見的病毒，其中IFVA占57.14%，IFVB占10.71%,與其他報道相符[15]，人HMPV感染也有明顯的季節特征，同樣在冬、春季節有較高的檢出率。然而，HRV、HADV多為散發，四季均有檢出，無明顯季節差別。

綜上所述，GeXP多重PCR技術簡便、快速、靈敏，可同時檢測多種呼吸道病毒核酸，輔助臨床的呼吸道感染診斷和治療。本研究還分析了老年患者RTI的流行病學特征，可為老年人呼吸道感染的預防和治療提供幫助。本研究的局限在于研究為單中心，今后有必要通過多中心進一步證實；另外，本研究旨在了解老年呼吸道感染患者病毒的流行特征，尚未對其他呼吸道病原體如細菌性病原體、肺炎支原體、肺炎衣原體等進行分析，后續計劃進行其他病原體的檢測及分析，為臨床診療提供更多有用的信息。除此之外，今后如能結合呼吸道病毒特征和患者的診療數據(如基礎性疾病、住院時長、影像學數據、實驗室數據等)，進行深入、全面地分析，將會獲得更有價值的結果。