C型產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)驗(yàn)感染仔豬腸道circRNA的表達(dá)特征

黃曉宇，楊巧麗，閆尊強(qiáng)，王鵬飛，石海仁，滾雙寶,3*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070； 2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，拉薩 850000；3.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens,C.perfringens)是一種革蘭陰性厭氧芽孢桿菌，廣泛分布于自然環(huán)境、人和動(dòng)物胃腸道微生物群[1-2]。產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠引起一系列人類和動(dòng)物腸道疾病(CAED)，例如氣體壞疽、食物中毒、壞死性小腸結(jié)腸炎、炎癥性疾病、仔豬腹瀉、綿羊腸毒血癥等[3-4]，逐漸成為引起人類和動(dòng)物組織中毒性疾病和腸道疾病的主要原因。按其所產(chǎn)4種主要致命毒素(α、β、ε和ι)類型不同，產(chǎn)氣莢膜梭菌被分為5種類型(A～E)[5]。

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringenstype C,C.perfringenstype C, Cp)是新生仔豬腹瀉的重要感染性病原體之一[6]，已成為仔豬高發(fā)病率和高死亡率的重要因素，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌被認(rèn)為是引起哺乳動(dòng)物高致命性、暴發(fā)性壞死性腸炎、小腸結(jié)腸炎和全身性疾病的主要原因[8], 同時(shí)也是幼畜死亡的一個(gè)重要原因[9]。此外，人類因食用受污染的動(dòng)物產(chǎn)品或直接接觸受感染的動(dòng)物亦會(huì)感染該菌[9]。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的α和β毒素進(jìn)入腸道，吸附在腸道黏膜上，經(jīng)腸道屏障系統(tǒng)被吸收到機(jī)體血液循環(huán)中，進(jìn)而影響其他器官，如大腦[4]。目前，一些動(dòng)物模型已被用來(lái)研究產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)的腸道疾病[10-13], 如雞、兔和鼠。但是目前關(guān)于仔豬如何應(yīng)答C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導(dǎo)致的腹瀉疾病尚不清楚。

circRNA是一種新型的非編碼RNA，由不含50-30極性和poly(A)尾孔的共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，經(jīng)數(shù)千個(gè)基因的前體mRNA (pre-mRNA)反向剪接產(chǎn)生，在細(xì)胞中更穩(wěn)定[14-15]。諸多研究表明，circRNA不僅可以通過(guò)激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄參與調(diào)控其功能，還能通過(guò)靶向miRNA、轉(zhuǎn)錄和干擾pre-mRNA剪接在基因表達(dá)中發(fā)揮潛在的調(diào)節(jié)作用[16-17]。但是目前有關(guān)circRNA如何參與調(diào)控仔豬應(yīng)答C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導(dǎo)致的腹瀉疾病尚不清楚。在本研究中，首先構(gòu)建一個(gè)C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染仔豬致腹瀉的動(dòng)物模型，并通過(guò)RNA測(cè)序全面描述C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染仔豬的回腸組織中circRNAs特異性表達(dá)譜，篩選并鑒定出差異表達(dá)的circRNAs，構(gòu)建與C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性疾病密切相關(guān)的ceRNA互作網(wǎng)絡(luò)，本研究不僅能為進(jìn)一步研究circRNA調(diào)控仔豬抵抗C型產(chǎn)氣莢膜菌性腹瀉提供基礎(chǔ)，還可為今后豬抗腹瀉新品系的培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株培養(yǎng)

將C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株CVCC 2032(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京)置于牛肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖晃培養(yǎng)16 h (青島海博生物)。采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落形成單位(CFU)。

1.2 動(dòng)物試驗(yàn)

選擇6頭7日齡長(zhǎng)大二元仔豬，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))檢測(cè)血清中大腸桿菌、沙門菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌均為陰性后作為試驗(yàn)仔豬，在適當(dāng)?shù)臍夂蚩刂坪屯耆綦x條件下單獨(dú)飼養(yǎng)，自由采食。隨機(jī)選取3頭仔豬經(jīng)口灌服1 mL 1×109CFU·mL-1C型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)液[18]，連續(xù)5 d，作為處理組(TI組)，剩余3頭仔豬灌服無(wú)菌培養(yǎng)液，作為對(duì)照組(CI組)。

接種后，每天監(jiān)測(cè)每只仔豬的健康狀況，包括行為、食欲、精神和毛發(fā)狀況。評(píng)估并記錄仔豬每天糞便黏稠度，按照腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定：0 =正常、固體糞便；1=輕微腹瀉，糞便柔軟疏松；2=中度腹瀉，質(zhì)軟不成型糞便；3=嚴(yán)重腹瀉、水樣糞便[19]。試驗(yàn)結(jié)束后，采用巴比妥酸鹽麻醉法人道屠宰6頭仔豬，無(wú)菌采集TI組和CI組仔豬的回腸組織樣品，用無(wú)菌PBS緩沖液(pH 7.4)沖洗干凈，液氮速凍并保存于-80 ℃超低溫冰箱，以備RNA提取。

1.3 總RNA提取和 circRNA測(cè)序

提取TI組和CI組樣品中總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，利用Qubit?RNA Assay Kit測(cè)定RNA濃度。使用NanoPhotometer分光光度計(jì)(IMPLEN, CA, USA)和RNA Nano 6000檢測(cè)試劑盒(Agilent Technologies, CA, USA)分別評(píng)估總RNA的純度和完整性。

取TI組和CI組樣品RNA 5 μg，按照說(shuō)明書去除樣品核糖體RNA (Epicentre RibozeroTMrRNA 去除試劑盒，Epicentre, 美國(guó))和線性RNA(RNase R，Epicentre, USA)。利用Next?UltraTMDirectional RNA Library Prep Kit制備circRNA測(cè)序文庫(kù)(NEB, 美國(guó))，通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估后，在Illumina Hiseq 4000平臺(tái)(Illumina, San Diego, CA, USA)上進(jìn)行測(cè)序，獲得150 bp配對(duì)端(PE150)序列。

1.4 數(shù)據(jù)比對(duì)

去除包含接頭序列、ploy-N和低質(zhì)量(>50% of bases with Phred scores<5)的原始數(shù)據(jù)后，獲取clean數(shù)據(jù)，通過(guò)計(jì)算clean數(shù)據(jù)的Q20、Q30和GC含量，使用Bowtie2[20]將clean reads與豬參考基因組進(jìn)行比對(duì)。

1.5 circRNA的鑒定和定量

使用clean reads中的find_circ[21]和CIRI2[22]檢測(cè)并識(shí)別circRNAs。首先使用TPM(Transcripts read count Per Kilobase Million)對(duì)潛在 circRNAs的原始計(jì)數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以評(píng)估表達(dá)水平[23]。

1.6 circRNAs差異表達(dá)分析

基于負(fù)二項(xiàng)分布，使用DESeq2 R包[24]對(duì)circRNAs進(jìn)行差異表達(dá)分析。采用Benjamini和Hochberg方法控制錯(cuò)誤發(fā)生率，以P值<0.05的circRNAs視為差異表達(dá)。

1.7 GO和KEGG富集分析

利用DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov)分析和預(yù)測(cè)差異表達(dá)circRNA的線性轉(zhuǎn)錄本；利用GOseq R包[25]和 KOBAS 2軟件[26]對(duì)差異表達(dá)circRNA宿主基因進(jìn)行Gene Ontology (GO)功能和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)信號(hào)通路富集分析。通過(guò)KOBAS軟件統(tǒng)計(jì)circRNA宿主基因的富集度[27]，校正P值<0.05為顯著富集。

1.8 circRNA-miRNA-gene互作網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)

通過(guò)miRanda軟件預(yù)測(cè)差異表達(dá)circRNA外顯子中的microRNA靶點(diǎn)，構(gòu)建circRNA/miRNA相互作用關(guān)系，用Cytoscape生成circRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)圖[28]。

1.9 circRNA-miRNA-gene基因網(wǎng)絡(luò)與CAED分析

為研究circRNA相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)與CAED之間潛在調(diào)控關(guān)系，首先篩選TI組和CI組仔豬回腸組織中顯著差異表達(dá)circRNAs、miRNAs及其靶mRNAs的數(shù)據(jù)集(校正P<0.05)，同時(shí)確保circRNAs、miRNAs及其靶miRNAs的表達(dá)水平在一定的數(shù)量級(jí)；其次，circRNA相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)與CAED相關(guān) (在Web of Science中搜索miRNA，在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索mRNA)；最后，進(jìn)一步篩選參與炎癥、免疫或感染等相關(guān)信號(hào)通路的差異表達(dá)circRNAs。根據(jù)上述4個(gè)步驟篩選與CAED相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。

1.10 qPCR驗(yàn)證及數(shù)據(jù)分析

采用熒光定量qPCR檢測(cè)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中6個(gè)circRNAs、3個(gè)miRNAs和4個(gè)mRNAs的表達(dá)水平，分別以GAPDH基因和U6基因作為內(nèi)參基因，引物信息見(jiàn)表1。采用9.5 μL 2 × SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TaKaRa，中國(guó)大連)，正、反引物各1 μL，1 μL cDNA和7.5 μL游離RNase ddH2O的20 μL反應(yīng)體系，在Roche熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，溶解曲線用于評(píng)價(jià)PCR產(chǎn)物的特異性。

表1 circRNA、miRNA 和 mRNA熒光定量qPCR引物信息

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用獨(dú)立樣本T-test 分析和單因素方差分析(one-way ANOVA)檢測(cè)TI組和CI組仔豬糞便腹瀉評(píng)分；定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，所得數(shù)值均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SE)”表示，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 仔豬腹瀉評(píng)分及糞便中C型產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量

Cp感染導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)了不同程度的腹瀉，對(duì)TI組和CI組仔豬的平均腹瀉評(píng)分和總腹瀉評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TI組仔豬的平均腹瀉評(píng)分和總腹瀉評(píng)分分別為1.51±0.29和37.33±2.51，均極顯著高于CI組仔豬的平均腹瀉評(píng)分0.49±0.03和總腹瀉評(píng)分12.00±1.00(P<0.01，表2)。

表2 TI組和CI組仔豬腹瀉評(píng)分統(tǒng)計(jì)分析

2.2 Cp感染仔豬回腸circRNA的鑒定

經(jīng)測(cè)序鑒定，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染后，TI組和CI組仔豬回腸組織中共檢測(cè)到3 162個(gè)circRNAs(圖1A)，這些circRNAs的長(zhǎng)度分布范圍為1～40 kb，大部分circRNA長(zhǎng)度小于3 kb(圖1B)，其中最大長(zhǎng)度為2 135 nt，最小長(zhǎng)度為22 nt，平均長(zhǎng)度為298 nt(圖1C)。大多數(shù)circRNA含有1～3個(gè)外顯子、內(nèi)含子或基因間區(qū)域(圖1D)。在染色體分布方面，這些鑒定到的circRNAs主要來(lái)源于編碼蛋白質(zhì)的基因外顯子區(qū)域(占81.39%)，部分來(lái)自基因間區(qū)域，少數(shù)來(lái)自內(nèi)含子區(qū)域(圖1E)。

A. 仔豬染色體circRNAs的鑒定； B. 不同全長(zhǎng)的circRNAs數(shù)量；C. 不同剪接長(zhǎng)度的circRNAs數(shù)量；D. circRNAs外顯子區(qū)、基因間區(qū)和內(nèi)含子區(qū)3種亞型特征；E. 仔豬回腸circRNAs分類

將Cp感染仔豬回腸組織 circRNA原始數(shù)據(jù)提交至NCBI Sequence Read Archive (SRA)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)PRJNA705036。

2.3 差異表達(dá)circRNA分析

對(duì)Cp感染的TI組和CI組鑒定到的3 162個(gè)circRNAs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2 854個(gè)circRNAs在兩組間共同表達(dá)，203個(gè)circRNAs和105個(gè)circRNAs僅在TI組和CI組中特異性表達(dá)(圖2A)。聚類結(jié)果顯示，TI組和CI組具有相同表達(dá)模式的circRNA聚類在一起(圖2B)。

以校正后P值 < 0.05為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)鑒定到的circRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析, 從TI組和CI組共鑒定到694個(gè)circRNAs顯著差異表達(dá), 其中上調(diào)表達(dá)404個(gè)circRNAs，下調(diào)表達(dá) 290個(gè)circRNAs(圖2C)。還對(duì)cirRNAs進(jìn)行了環(huán)狀基因組分析(圖3)，TI組和CI組中差異表達(dá)cirRNAs主要分布在1、2、3、6、8、9、13、14、15和X染色體上，每條染色體上分布的差異表達(dá)cirRNAs數(shù)量和差異倍數(shù)差別明顯(圖3)。

A. 維恩圖；B. 聚集熱圖，行表示差異表達(dá)circRNAs，列表示不同樣本；C. 火山圖，紅點(diǎn)和藍(lán)點(diǎn)分別代表上調(diào)和下調(diào)的circRNAs

紅色代表上調(diào)circRNAs，綠色代表下調(diào)circRNAs

2.4 功能富集分析

circRNAs的功能與circRNA的親本基因的功能相關(guān)。對(duì)TI組與CI組間差異表達(dá)circRNAs的親本基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)circRNAs主要富集在135個(gè)GO功能(校正P<0.05)，其中包括52個(gè)極顯著富集的GO功能(校正P<0.01)，包括26個(gè)生物過(guò)程、25個(gè)細(xì)胞組分和1個(gè)分子功能，如細(xì)胞器組織、細(xì)胞代謝過(guò)程、細(xì)胞大分子代謝過(guò)程等(圖4A)。KEGG信號(hào)通路富集分析鑒定出197條顯著富集的信號(hào)通路，top20富集的KEGG通路包括細(xì)胞周期、TGF-beta信號(hào)通路、賴氨酸降解、Wnt信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等(圖4B)，表明差異表達(dá)circRNAs通過(guò)其親本基因參與了細(xì)胞、免疫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，揭示了差異表達(dá)circRNA親本基因的潛在功能。

圖4 TI組和CI組之間差異表達(dá)circRNA 親本基因GO功能(A)和KEGG信號(hào)通路(B)富集分析

2.5 circRNA-miRNA-mRNA相互作用關(guān)系預(yù)測(cè)

通過(guò)circRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序從Cp感染的仔豬回腸組織中鑒定出694個(gè)顯著差異表達(dá)circRNAs，結(jié)合課題組前期從Cp感染組和對(duì)照組仔豬回腸組織中鑒定出53個(gè)顯著表達(dá)miRNAs[29]和3 669個(gè)顯著表達(dá)mRNAs[30]，構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA交互網(wǎng)絡(luò)(包括349個(gè)circRNA、36個(gè)miRNAs和233個(gè)mRNAs)(圖5)，如circ0006008- ssc-let-7i- TARBP2，circ0002897- miR-24-3p- ITM2C，circ0003611- miR-365-5p- NFKBID， circ0009977- miR-7134-3p- IL17RC等。這些ceRNA網(wǎng)絡(luò)基因可能在仔豬應(yīng)答Cp感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.6 circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)與CAED關(guān)系分析

為進(jìn)一步分析circRNA相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)與CAED之間可能存在的關(guān)系，篩選出由8 circRNAs-5 miRNAs-12 mRNAs組成的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，由圖6可知，novel-circ0004881能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-17-3p調(diào)控S100A9基因和ERBB2基因，novel-circ0014949能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-204調(diào)控FAM167基因的表達(dá)，novel-circ0008552能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-500調(diào)控RENBP、C5AR1和FADS3基因的表達(dá)。

2.7 qPCR驗(yàn)證

對(duì)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的6個(gè)circRNAs，3個(gè)miRNAs和4個(gè)mRNAs的表達(dá)量進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果表明：circ0004881、circ0008552和circ0014117表達(dá)水平極顯著上調(diào)(P<0.01)，circ0008686和circ0002381表達(dá)水平極顯著下調(diào)(P<0.01)，miR-500、miR-17-3p、miR-204及S100A9、RENBP基因表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，但circ0001746、C5AR1和FADS3基因表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，這些基因的表達(dá)水平與測(cè)序結(jié)果均一致(圖7)。

數(shù)據(jù)以“平均值±SEM”表示；*. P<0.05; **. P<0.01

3 討 論

近十年，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌被認(rèn)為是引起仔豬急性高度傳染性腹瀉、腸道炎癥性疾病及壞死性腸炎的重要致病菌之一，嚴(yán)重威脅著世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[3]。目前有關(guān)C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起仔豬腹瀉的研究主要集中在發(fā)病機(jī)制和疾病診斷、病理檢測(cè)等方面，由于人們對(duì)豬抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染性腹瀉疾病的調(diào)控機(jī)制研究不足，使得該類疾病目前尚無(wú)有效的治療方法。circRNAs是一種新發(fā)現(xiàn)的特殊非編碼RNA，廣泛存在于各類細(xì)胞中，具有充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，調(diào)控其親本基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄等多種生物學(xué)功能[31]。circRNA相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)可能在許多免疫和炎性疾病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[32-33]。研究報(bào)道腸道組織has-circ-001569的表達(dá)與miRNA-145水平呈負(fù)相關(guān)，與miRNA-145靶基因E2F5、BAG4和FMNL2水平呈正相關(guān)，has-circ-001569通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-145，調(diào)控其靶基因E2F5、BAG4和FMNL2基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲[34]。然而，circRNA如何調(diào)控仔豬應(yīng)答C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的腹瀉疾病尚不清楚。

本研究報(bào)道了C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的仔豬回腸circRNA的表達(dá)模式，經(jīng)分析，在TI組和CI組中共鑒定到3 162個(gè)circRNAs，其中694個(gè)circRNAs顯著差異表達(dá)(P<0.05)，包括404個(gè)circRNAs上調(diào)表達(dá)，290個(gè)circRNAs下調(diào)表達(dá)。為了進(jìn)一步了解差異表達(dá) circRNA的功能，本研究進(jìn)行了差異表達(dá)circRNA的功能富集分析。值得注意的是，差異表達(dá)的circRNAs主要富集在12個(gè)KEGG信號(hào)通路，如TGF-beta信號(hào)通路、T細(xì)胞受體和MAPK等免疫相關(guān)信號(hào)通路，這些通路被報(bào)道是與C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染性疾病密切相關(guān)的信號(hào)通路[29]，該結(jié)果說(shuō)明，circRNA可通過(guò)免疫相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控仔豬應(yīng)答C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的腹瀉疾病。

本課題組前期報(bào)道了C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染仔豬回腸miRNA和mRNA的動(dòng)態(tài)變化[29-30]，結(jié)合該數(shù)據(jù)，在分析circRNA、miRNA和mRNA表達(dá)相關(guān)性的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步構(gòu)建了C型產(chǎn)氣莢膜感染仔豬回腸組織差異表達(dá)circRNA相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共形成了836條circRNA、miRNA和mRNA相關(guān)關(guān)系(圖5)。在此ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)一些circRNA可以與miR-15b、miR-21和miR-17-3p等競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，miR-15b、let-7i、S100A9、IL7R、IL17RC、CD101和TARBP2等免疫相關(guān)分子均被報(bào)道與宿主免疫系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。有研究報(bào)道，miR-15b、miR-17-3p、miR-29a和miR-21被認(rèn)為與結(jié)直腸癌(CRC)和炎癥性腸炎(IBD)等疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可作為疾病診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物[35-36]。miR-15b與宿主空腸和回腸中某些細(xì)菌的拷貝數(shù)呈正相關(guān)，可作為免疫細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)劑，對(duì)宿主腸道的發(fā)育具有潛在的調(diào)控功能[37]。因此推測(cè)，circRNA可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA調(diào)控靶mRNA，在仔豬應(yīng)答C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染性腹瀉過(guò)程中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

藍(lán)色正方形代表mRNA，紅色圓圈代表miRNA，黃色三角形代表circRNA

本研究篩選出了與CEAD相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括8個(gè)circRNAs，5個(gè)miRNAs和12個(gè)mRNAs，如circ-0004881-miR-17-3p-S100A9、circ-0002381-miR-338-FMVK、circ-0014949-miR-204-FAM167等，其中circ-0008552-miR-500與RENBP、C5AR1和FADS3均具有潛在的靶向關(guān)系(圖6A)。qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，Cp感染導(dǎo)致仔豬回腸miR-17-3p的表達(dá)顯著上調(diào)，其上游circ-0004881和下游靶基因S100A9的表達(dá)均顯著上調(diào)。miR-17-3p被circ-0004881競(jìng)爭(zhēng)性吸附，抑制3種線粒體抗氧化酶:錳超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶2和硫氧還蛋白還原酶2，協(xié)同有效地去除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，提高腫瘤的治療效率[38]。鈣結(jié)合蛋白基因S100A9具有調(diào)控細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、參與炎性應(yīng)答、影響炎癥細(xì)胞的遷移、抵抗病原菌多種生物功能[39-40]。LPS通過(guò)抑制細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和促炎癥因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生炎癥損傷。Zhao等[41]利用脂多糖(LPS)感染小鼠，發(fā)現(xiàn)LPS處理的小鼠肺組織中S100A9基因的表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明S100A9基因的表達(dá)水平與LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。S100A9能顯著改善小鼠結(jié)腸組織的炎癥反應(yīng)，減少免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)的浸潤(rùn)和促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6等)的產(chǎn)生[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cp感染導(dǎo)致仔豬回腸S100A9基因顯著上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明circ-0004881可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-17-3p，影響S100A9基因的表達(dá)，參與仔豬抵抗Cp感染過(guò)程。

圖6 circRNA相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)與CAED之間的潛在關(guān)系

LPS刺激能夠激活巨噬細(xì)胞miR-500的表達(dá)上調(diào)，通過(guò)靶向MFN2抑制TGF-β/Smad的激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖和活化[43]。Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，miR-500通過(guò)靶向調(diào)控ELK1、HSPA2、IL7R基因參與抵制Cp感染引起的仔豬疾病。上調(diào)表達(dá)的miR-500能通過(guò)抑制靶基因的表達(dá)，激活泛素偶聯(lián)受體相互作用蛋白1(RIP1)和NF-κB, 促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和存活[44]。C5AR1是一種炎癥驅(qū)動(dòng)因子，巨噬細(xì)胞能通過(guò)C5AR1的先天免疫反應(yīng)，增加TNF-α炎癥反應(yīng)，加劇機(jī)體炎癥因子的產(chǎn)生。補(bǔ)體在AOM/dss誘導(dǎo)的小鼠CRC模型的炎癥組織中被廣泛激活，導(dǎo)致多方面的后果。高表達(dá)的C5AR1可能通過(guò)調(diào)節(jié)某些關(guān)鍵細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，損傷CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)腸道炎癥的發(fā)生，可能是腸道炎癥和腸癌發(fā)生的主控調(diào)控因子[45]。FADS3被認(rèn)為是B細(xì)胞特異性基因，能夠特異性結(jié)合NK-κB、p63轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體的細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激反應(yīng)[46]。本研究中，circ-0008552和miR-500在Cp感染導(dǎo)致仔豬回腸組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，C5AR1和FADS3基因的表達(dá)顯著下調(diào)，因此推測(cè)，circ-0008552可能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-500，負(fù)調(diào)控C5AR1和FADS3基因的表達(dá)，參與Cp感染仔豬致腹瀉的過(guò)程。miR-204可以通過(guò)靶基因特異性抑制炎癥細(xì)胞的增殖、自噬并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[47]，被認(rèn)為是治療免疫、炎癥和癌癥相關(guān)疾病的潛在靶點(diǎn)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，miR-204在Cp感染腹瀉仔豬回腸組織和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌CPB2毒素處理的腸上皮細(xì)胞IPEC-J2中均顯著高表達(dá)，此外過(guò)表達(dá)miR-204促進(jìn)了豬IPEC-J2的凋亡和炎癥反應(yīng)，抑制miR-204 則減弱了細(xì)胞的炎性反應(yīng)[48]。本研究中，Cp感染導(dǎo)致仔豬回腸組織miR-204的表達(dá)水平顯著上調(diào)，可能促進(jìn)了Cp感染導(dǎo)致的仔豬腸道炎癥及腹瀉癥狀。

4 結(jié) 論

本研究綜合分析了C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的仔豬回腸組織 circRNA差異表達(dá)譜，篩選出694個(gè)差異表達(dá)circRNAs，主要富集在TGF-β、T細(xì)胞受體、MAPK等信號(hào)通路，構(gòu)建出由8 circRNAs-5 miRNAs-12 mRNAs組成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)與C型產(chǎn)氣莢膜菌感染致仔豬腹瀉相關(guān)，其中circ-0004881-miR-17-3p-S100A9可能在Cp感染引起的仔豬腹瀉過(guò)程中發(fā)揮潛在功能。