奶牛牧場養殖環境中產ESBL耐藥菌的流行特征

左 揚，李 田，胡秀花，宋志強，孫城濤，吳聰明，王少林*

(1.中國農業大學動物醫學院，北京 100193； 2.內蒙古伊利實業集團股份有限公司，呼和浩特 010080)

奶牛乳房炎是奶牛養殖中的常見疾病，不僅危害奶牛本身健康，增加病牛的淘汰率，還會在影響牛奶品質及引發食品衛生安全問題的基礎上造成生產經濟的巨大損失。根據美國國家乳房炎委員會(National Mastitis Council, NMC)報告表明，由奶牛乳房炎造成的全球經濟損失高達390億美元[1]；而我國據統計約有1 400萬頭奶牛，僅臨床型奶牛乳房炎的每年發生率可高達60%，平均年發生率為33.4%，每年造成的經濟損失超過6億元人民幣[2]。

病原微生物是引起奶牛乳房炎最重要的原因，包括細菌、真菌、支原體、病毒等，細菌占95%以上，其中，金黃色葡萄球菌是造成奶牛養殖行業經濟損失的關鍵因素，肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎與其他細菌性乳房炎相比更難控制[3]。根據病原菌的感染方式與傳播途徑，可以將引起奶牛乳房炎的病原菌又分為傳染性病原菌和環境性病原菌，其中，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、無乳鏈球菌等分離率最高(表1)。

表1 中國各地區常見奶牛乳房炎病原種類

β-內酰胺類抗生素是包括奶牛乳房炎在內的各種抗感染治療的首選抗生素，隨著近幾十年的廣泛應用，病原菌經基因突變產生了超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases，ESBL)[17]，并且已有研究表明ESBL的出現是目前耐藥菌對廣譜β-內酰胺類抗生素產生抗性的重要原因。編碼ESBL的基因具有多種類型，目前，全球大約發現300種，主要分為3種：blaCTX-M、blaSHV和blaTEM[18]，編碼ESBL的基因可以在不同菌種的細菌之間通過克隆或基因的水平轉移傳播[19]。迄今為止，有多種病原菌都被報道攜帶編碼該酶的基因。就乳房炎病原菌來說，國外包括日本、英國、法國、德國、印度以及突尼斯等國家報道的產ESBL乳房炎病原菌常見腸桿菌科細菌，基因類型以CTX-M型為主[20-25]。而國內近幾年報道的產ESBL乳房炎病原菌以大腸桿菌、肺炎克雷伯菌最為常見[26-27]，此外還包括鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌、蠟樣芽胞桿菌、銅綠假單胞菌等，攜帶的ESBL耐藥基因以TEM、CTX-M、OXA型多見[28-29]。這些產ESBL病原菌導致了奶牛乳房炎的高發生率和低治愈率，極大地限制了奶牛乳房炎的臨床用藥，增加了奶牛養殖業的經濟損失。

現今的奶牛養殖模式使大數量的奶牛暴露在一個共同的養殖環境下，若養殖環境中存在較多產ESBL耐藥菌，在奶牛躺臥、擠奶操作不當等情況下使產ESBL耐藥菌進入奶牛乳區成為引起奶牛乳房炎的病原菌，增加環境耐藥菌引起奶牛乳房炎的危險性[30]。并且產ESBL耐藥菌在進入牛奶后經藥物作用會產生內源性β-內酰胺酶。自2009年起，衛生部《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治抽檢工作指導原則和方案》的通知(食品整治辦〔2009〕29號)中明文規定：“添加β-內酰胺酶(拮抗劑)等非食品用物質屬違法行為”[31]。不同學者對北京[32]、江蘇淮安[33]、新疆巴州[34]等地區的市售牛乳或生鮮牛乳進行了內酰胺酶殘留檢測，發現每個地區的檢測樣品均有陽性檢出，且樣品來源廣泛。但是常規檢測方法無法區分耐藥菌產生的內酰胺酶與人工添加的內酰胺酶，牧場只能對內酰胺酶陽性的牛奶丟棄或者銷毀，對牧場造成巨大的經濟損失。因此，對于奶樣呈現內酰胺酶陽性的牧場應盡快開展溯源工作，消除污染源。

綜上，本研究對5個牧場的產ESBL耐藥菌進行了流行性研究，并對第6個牧場原奶內酰胺酶的來源進行追溯研究，為控制牧場中內酰胺酶的流行提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

大腸桿菌ATCC 25922購自美國典型微生物菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)；科瑪嘉ESBL顯色鑒別培養基購自法國梅里埃公司；阿莫西林購自中國藥品生物制品鑒定所；頭孢他啶購自北京偶合科技公司；頭孢噻肟購自Sigma-Aldrich公司；β-內酰胺酶快速檢測試紙條購自北京維德維康生物技術有限公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀購自德國Bruker公司。

1.3 試驗設計

1)對內蒙古和寧夏5個牧場養殖環境產ESBL耐藥菌流行特征研究，2)對第6個“內酰胺酶檢測長期陽性”特殊牧場的內源性內酰胺酶進行溯源研究。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣本采集 樣本采集時間為2020—2021年，采集對象為內蒙古和寧夏6個牧場養殖奶牛的牛奶以及與奶牛養殖相關的樣本，6個牧場分別以A、B、C、D、E和F命名，其中，F為“內酰胺酶檢測長期陽性”牧場。采樣過程隨機，力求覆蓋牧場。采集直接使用15 mL離心管采集目標樣本，并且采樣過程中使用無菌技術，戴無菌乳膠手套。采集完成后，在簡易冰盒中妥善保存，并加急送往實驗室，收到立即進行分菌工作，而后將其保存于-80 ℃冰柜中備用。

1.4.2 牛奶樣本β-內酰胺酶檢測 采用β-內酰胺酶快速檢測試紙條法對6個牧場的24份牛奶樣本進行檢測(外加1份上市奶粉樣用作陰性對照)。

1.4.3 產ESBL耐藥菌的分離鑒定 所有樣本均采用“三區劃線法”劃線科瑪嘉ESBL顯色鑒別培養基，37 ℃培養18～24 h后，用一次性接種環挑取顏色不一的可疑菌落，再次劃線加有2 μg·mL-1頭孢噻肟的BHA瓊脂平板，37 ℃18～24 h后，挑單菌落采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法(matrix-assisted laser desorption/ioniation time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)進行細菌的種屬鑒定。

首先對任務之間的距離進行計算，然后通過聚類將距離相近的任務分群。最后根據任務群周邊信息和打包策略確定最終的定價方案。對比分析任務標價情況，發現打包后任務標價分布更加密集，任務標價相比打包前更加統一，更有利于提高任務成功率。

1.4.4 藥敏試驗 采用瓊脂稀釋法進行藥敏試驗，以大腸桿菌ATCC 25922為質量控制標準菌株，測定A～E 5個牧場牛奶樣本、乳區皮膚拭子以及環境樣本中分離到的產ESBL耐藥菌對阿莫西林、頭孢他啶、頭孢噻肟3種β-內酰胺類抗生素的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，測定MIC后參照CLSI標準及EUCAST標準判斷菌株的耐藥表型。

1.4.5 菌株全基因組測序 A和D牧場選擇14株分別來源于牛奶、皮膚拭子以及環境中的產ESBL大腸桿菌，F場選擇兩株分別來源于健康奶牛和乳房炎奶牛的牛奶樣本的產ESBL鮑曼不動桿菌，用細菌DNA提取試劑盒提取菌株基因組，而后送北京賽默百合公司進行全基因組測序。

2 結 果

2.1 牧場中產ESBL耐藥菌流行情況

A～E 5個牧場采集了17份牛奶樣本、97份乳區皮膚拭子樣本以及39份養殖環境樣本(包括新鮮糞便、臥床墊料、運動場土壤和污糞、舍飼草料等)，F牧場采集了7份牛奶樣本(表2)。樣本來源涵蓋健康奶牛以及乳房炎奶牛。根據試紙條的檢測結果表明，上市奶粉樣確為陰性，24份牛奶樣本的檢測結果成立。據統計前5個牧場的17份樣本共檢測出16份陽性樣本，1份陰性樣本，0份無效樣本；F牧場7份樣本全為陽性。此外A～E 5個牧場17份牛奶樣本僅A和D場各分離出兩株產ESBL大腸桿菌(extended-spectrum beta-lactamases resistantEscherichiacoli, ESBL-Ec)，其余136份樣本中有65份樣本分離到產ESBL耐藥菌?？傊贏場(51.6%，16/31)、B場(33.3%，10/30)、C場(53.3%，16/30)、D場(35.5%，11/31)和E場(51.6%，16/31)中均有不同種類的產ESBL耐藥菌被分離出來，以產ESBL大腸桿菌占比最大(79.5%，62/78)，其余為產ESBL塞氏檸檬酸桿菌(9.0%，7/78)、產ESBL陰溝腸桿菌(5.1%，4/78)、產ESBL鮑曼不動桿菌(2.6%，2/78)、產ESBL肺炎克雷伯菌(2.6%，2/78)以及產ESBL丙二酸鹽陰性枸櫞酸桿菌(1.3%，1/78)等；以上分離菌株對阿莫西林(100%)耐藥率最高，而后依次為頭孢噻肟(91.0%)、頭孢他啶(78.2%)。

表2 樣本采集明細

F牧場的7份牛奶樣本共分離出2株產ESBL鮑曼不動桿菌，一株來源于健康奶牛，另一株來源于乳房炎奶牛。

2.2 產ESBL耐藥菌的基因組特征

根據細菌全基因組測序結果顯示，測序的產ESBL大腸桿菌檢測到多種類型的耐藥基因，包括氨基糖苷類耐藥基因、β-內酰胺類耐藥基因、磺胺及增效劑耐藥基因、林可胺類耐藥基因、大環內酯類耐藥基因以及四環素類耐藥基因等，其中，以β-內酰胺類耐藥基因的攜帶率最高，尤其是blaCTX-M的攜帶率高達100%；氨基糖苷類耐藥基因、磺胺類耐藥基因、大環內酯類耐藥基因以及四環素類耐藥基因的攜帶率均為33.3%；林可胺類耐藥基因僅1株分離菌株攜帶，攜帶率為6.7%。并且A場有3株(37.5%，3/8)、D場有4株(57.1%，4/7)分離菌株攜帶有兩種或兩種以上耐藥基因。

另外，F場的兩株產ESBL鮑曼不動桿菌經全基因組測序發現它們的MLST分型相同，并攜帶相同的毒力基因和β-內酰胺類耐藥基因(表3)。

表3 兩株產ESBL鮑曼不動桿菌的全基因組測序結果

3 討 論

經調查發現，這些牧場在奶牛乳房炎的治療或其他感染性疾病的治療中多使用β-內酰胺類抗生素，但不同牧場在抗生素的使用方面有一定的習慣與偏好，導致來自不同牧場的樣本分離出的產ESBL耐藥菌的菌株以及分離菌株的耐藥情況都有不同程度的差異。從分離結果來看牧場的產ESBL耐藥菌主要是腸桿菌科細菌，以環境分離率高，但也有部分來自牛奶，與國內外報道情況類似[35-37]。奶牛牧場養殖環境中廣泛存在產ESBL耐藥菌，這些細菌在增加奶牛乳房炎感染概率的同時，還會降低抗生素的治療效果，而且該類型細菌產生的β-內酰胺酶還會極大程度地降低牧場牛奶質量，并使其檢測不合格。以上均嚴重影響牧場的經濟效益。隨著耐藥菌的迅速傳播與發展，抗生素聯合用藥顯得更為重要。

自20世紀80年代以來，β-內酰胺類抗生素與β-內酰胺酶抑制劑的組合制劑隨勢而生且不斷發展，至今上市的β-內酰胺酶抑制劑有克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦、阿維巴坦和法硼巴坦5種，組合制劑有頭孢他啶-阿維巴坦、亞胺培南-西司他丁-雷利巴坦以及美羅培南-法硼巴坦等[38]。而獸用的組合制劑主要是阿莫西林-克拉維酸鉀片、阿莫西林鈉克拉維酸鉀注射液、氨芐西林-舒巴坦甲苯磺酸鹽以及注射用氨芐西林鈉-舒巴坦鈉[39]。牧場在單獨使用β-內酰胺類抗生素無效情況下可以嘗試使用這些組合制劑，以提高抗菌藥物對產ESBL耐藥菌的抑制和/或殺滅作用。

自采集于A和D場的產自乳房炎奶牛的牛奶樣本、乳區皮膚拭子樣本以及環境樣本中分離純化獲得的ESBL-Ec經過細菌全基因組測序可發現，它們均攜帶有β-內酰胺類耐藥基因blaCTX-M，推測這些基因很可能來源于環境。奶樣中β-內酰胺酶檢出率很高，在排除外源人為非法添加β-內酰胺酶后，內源性β-內酰胺酶需要引起高度重視。推測其來源有3種可能性：1)奶牛體內其他來源的產β-內酰胺酶耐藥菌進入奶牛乳腺產生的，但未引起奶牛乳房炎或/和未引起奶牛明顯全身癥狀，這些產酶菌很可能來源于牧場養殖環境；2)引起奶牛乳房炎的產β-內酰胺酶耐藥菌產生的，很可能也來源于牧場養殖環境；3)大罐奶存放時被環境中的產β-內酰胺酶耐藥菌污染，且奶中可能有抗生素殘留，耐藥菌與抗生素相互作用后產生β-內酰胺酶。

F牧場采集的7份牛奶樣本中，分離出產ESBL鮑曼不動桿菌的樣本β-內酰胺酶檢測呈陽性，通過細菌全基因組測序發現兩株不同來源的產ESBL鮑曼不動桿菌具有高度相似性。產ESBL鮑曼不動桿菌一般主要存在于奶牛養殖環境中，可以從堆肥、墊料、運動場等環境中分離到，所以推測產ESBL鮑曼不動桿菌是造成該場β-內酰胺酶檢測長期陽性的主要菌株，很可能來源于環境。

4 結 論

本研究揭示了A、B、C、D和E這5個牧場養殖環境中產ESBL耐藥菌廣泛存在，并探明耐藥菌攜帶的耐藥基因類型；明確β-內酰胺酶在原奶中廣泛分布，評估牧場產ESBL耐藥菌存在的風險；探明造成F牧場原奶中內酰胺酶檢測長期陽性的原因，為指導牧場乳房炎的防控與治療提供科學依據。