伯氏瘧原蟲ANKA株感染小鼠的T細胞、NK細胞及細胞因子變化

張義偉，蘇紫薇，李其龍，陳 冉，姜 寧

(重要家畜疫病研究教育部重點實驗室 沈陽農業大學動物科學與醫學學院，沈陽 110866)

瘧疾是由瘧原蟲引起的世界上危害最嚴重的疾病之一。據WHO報告統計，自青蒿素的普及以來，全球瘧疾控制取得了前所未有的成功，但每年仍有超過40萬人死于瘧疾。一方面和最近幾年出現的抗青蒿素蟲株有關[1-3]；另一方面，和瘧原蟲復雜且精密的免疫逃避方式有關。這表明，尋找有效的藥物靶標及開發瘧疾疫苗迫在眉睫。已有研究表明，針對抗瘧原蟲免疫反應方面設計的藥物，可以有效地控制瘧原蟲在所有發育階段的感染[4]。因此，研究瘧原蟲感染引起宿主的免疫反應過程尤為重要。

瘧原蟲在宿主體內寄生可引起強烈的免疫應答反應，免疫機制復雜多樣。T細胞是清除機體瘧原蟲的重要組成部分[5-6]，可通過直接產生如IFN-γ和TNF-α等促炎細胞因子，引發巨噬細胞和其他組分的抗寄生蟲免疫應答[7]，或激活產生抗瘧原蟲抗體的特異性B細胞從而介導間接的抗寄生蟲免疫反應[8]。NK細胞可通過細胞毒性和產生促炎細胞因子來破壞受損、功能失調或被感染的宿主細胞，從而控制感染的進程[9]。在機體的免疫清除進程中，T細胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule 3, Tim-3)作為一種免疫檢查點分子，對T細胞和NK均具有負性調節功能[10-12]，在腫瘤以及一些病原體的免疫逃避進程中發揮著重要作用。

在所有人類瘧原蟲感染中，惡性瘧原蟲引起的疾病是導致死亡的主要因素，感染后常出現腦型瘧的癥狀。而可以感染小鼠的伯氏瘧原蟲ANKA株是一種致命的強毒力蟲株，已有的研究表明，在惡性瘧原蟲感染的患者和伯氏瘧原蟲ANKA株感染的C57BL/6小鼠的體內，關鍵免疫細胞表面Tim-3表達均升高[13]，但整個感染進程中Tim-3的表達變化及相關細胞因子的變化還未可知。一項在昆明小鼠體內的研究顯示：利用熒光定量PCR檢測技術，發現感染伯氏瘧原蟲ANKA株后，小鼠脾Tim-3、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10和TGF-β的轉錄水平均升高[14]，但這些僅是在轉錄水平上的變化情況，此外，不同品系小鼠感染瘧原蟲引起的病理和免疫反應也存在差異[15-16]。伯氏瘧原蟲ANKA株感染C57BL/6小鼠后也常會引起腦型瘧發生，故已被廣泛用作研究人類惡性瘧疾疾病的試驗模型。因此，本研究以伯氏瘧原蟲ANKA株和C57BL/6小鼠為試驗材料，對瘧原蟲感染引起的宿主免疫應答特點進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與蟲株 SPF級雌性C57BL/6小鼠(N型)，鼠齡6～8周齡，體重20～22 g，購自遼寧本溪長生生物技術有限公司。

伯氏瘧原蟲ANKA株由沈陽農業大學動物科學與醫學學院人畜共患病重點實驗室保存。

1.1.2 抗體 Pacific BlueTManti-mouse CD45 Antibody、APC anti-mouse CD3 Antibody、FITC anti-mouse CD8a Antibody、APC/FireTM750 anti-mouse CD4 Antibody、FITC anti-mouse NK1.1 Antibody、PE anti-mouse CD366 (Tim-3) Antibody、Pacific BlueTMRat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody、APC/FireTM750 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody、APC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody、FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody、PE Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody、LEAFTMPurified anti-mouse CD16/32 Antibody、7-AAD Viability Staining Solution和Mouse Th Cytokine Panel (5-plex)細胞因子檢測試劑盒購自北京達科為生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 以感染伯氏瘧原蟲強毒株ANKA株的C57BL/6小鼠為研究對象，分別于感染后0、4、7、9、11、13、16和19 d采集小鼠脾及外周血免疫細胞，利用流式細胞術檢測小鼠主要免疫細胞亞群及Tim-3的表達水平的變化，同時檢測血清中細胞因子水平的變化(圖1)。

圖1 試驗分組及試驗流程

1.2.2 蟲株的準備 將伯氏瘧原蟲ANKA株從液氮罐中復蘇，離心洗滌后將蟲體迅速腹腔注射至C57BL/6小鼠體內。大約3 d后采取尾尖血制作血涂片，Giemsa染色檢測染蟲情況。約5 d后采集尾尖血至預冷的1×PBS中準備接種下一批小鼠，這批小鼠為第二代染蟲小鼠。如此反復傳三代，待蟲株毒力穩定后，即可用于后續感染模型建立試驗。

1.2.3 伯氏瘧原蟲ANKA株感染模型的建立 第三代染蟲小鼠體內染蟲率到達2%～3%時，取小鼠外周全血準備攻蟲：64只雌性C57BL/6小鼠隨機分為8組：0 d組、4 d組、7 d組、9 d組、11 d組、13 d組、16 d組和19 d組，每組8只。除8只健康小鼠(即0 d組)外，其余小鼠每只腹腔注射 2×105個染蟲紅細胞，在相同的環境中飼養。

1.2.4 樣本的采集 利用眼球采血的方法采集小鼠外周血，其中一部分放于抗凝管中用于免疫細胞的流式細胞術檢測，一部分用于血清的分離。小鼠斷頸處死，采取脾并稱重。分離的血清置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測細胞因子。

1.2.5 脾單細胞懸液的制備 將脾放置于200目細胞篩，置于50 mL離心管上，邊加PBS邊用注射器尾部充分研磨；研磨好的細胞懸液轉移至15 mL離心管中，1 500 r·min-1離心7 min，棄上清，根據沉淀體積加入3～10 mL的紅細胞裂解液，充分震蕩混勻，冰上孵育3～5 min；1 500 r·min-1離心7 min后棄掉上清，沉淀用10 mL的1×PBS 重懸，重復2次。顯微鏡下計算細胞數量。

1.2.6 流式細胞術檢測不同免疫細胞亞群 從每只小鼠采取的抗凝血中取出100 μL加入離心管中，之后加入相應的抗體組合，充分混勻；4 ℃避光孵育30 min后，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，冰上孵育3 min，1 500 r·min-1離心7 min后棄上清；加入1 mL 1×PBS重懸細胞，離心，棄上清；加入300 μL 1×PBS重懸細胞，將細胞懸液通過200目濾網，準備上機檢測。

將脾細胞懸液調整每管細胞的終濃度為每100 μL含1×106個細胞；加入CD16/32抗體，冰上孵育10 min封閉Fc位點；將上述細胞每管取100 μL加入離心管中；加入相應的抗體組合，充分震蕩混勻；4 ℃避光孵育30 min，離心，清洗3遍。最終，加入300 μL 1×PBS重懸細胞，細胞懸液通過200目濾網，上機檢測。

1.2.7 血清中細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10)的檢測 按照試劑盒說明書方法進行操作。

1.2.8 統計與分析 所有分析均使用GraphPad Prism 6進行。多組間比較時，采用雙尾t檢驗或方差分析對結果進行分析。結果使用Excel進行計算，以“平均值±標準差(Mean±SD)”表示。P值小于0.05被認為具有統計學意義。

2 結 果

2.1 感染伯氏瘧原蟲不同時期小鼠脾指數變化

如圖2所示，感染伯氏瘧原蟲后小鼠的脾指數(脾指數=脾重量(mg)/體重(g)×10)在0～13 d逐漸升高(P<0.001)；16～19 d小鼠脾指數不再繼續升高，感染19 d小鼠與16 d小鼠相比，脾指數降低(P<0.05)，但仍顯著高于健康對照組(0 d組)(P<0.001)。

&. P<0.05, ***. P<0.001, *代表與0 d組進行比較；& 代表19 d組與16 d組進行比較

2.2 感染伯氏瘧原蟲不同時期小鼠脾中T細胞及T細胞表面Tim-3的表達情況

利用流式細胞術檢測伯氏瘧原蟲ANKA株感染小鼠后脾T細胞主要亞群比例及Tim-3的表達情況的變化，圖3A為細胞圈門方案。與未感染組(0 d組)相比，感染4 d，小鼠脾CD3+CD4+T細胞比例顯著降低(P<0.001)，且隨感染時間的延長，除7 d外，脾CD3+CD4+T細胞比例均顯著低于0 d未感染組(圖3B)。與未感染組(0 d組)相比，小鼠脾CD3+CD8+T細胞比例隨感染時間的延長逐漸降低(P<0.001,圖3C)。如圖3D和圖3E所示，隨感染時間延長，小鼠脾Tim-3+CD3+CD4+T細胞和Tim-3+CD3+CD8+T細胞比例逐漸升高(P<0.001)。為了進一步確認CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞表面Tim-3的表達情況，利用流式細胞術檢測了這兩種細胞表面Tim-3分子的平均熒光強度(median fluorescence intensity，MFI)。結果顯示，Tim-3分子在CD3+CD4+T細胞(圖3F)和CD3+CD8+T細胞(圖3G)表面的表達均逐漸增加。

A. 流式細胞圈門方案； B. CD3+CD4+ T細胞比例統計結果；C. CD3+CD8+ T細胞比例統計結果；D. Tim-3+CD3+CD4+ T細胞比例統計結果；E. Tim-3+CD3+CD8+ T細胞比例統計結果；F. Tim-3在CD3+CD4+ T細胞的表達變化；G. Tim-3在CD3+CD8+ T細胞的表達變化。*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001, *代表與0 d組進行比較。下圖同

2.3 感染伯氏瘧原蟲不同時期小鼠外周血中T細胞及T細胞表面Tim-3的表達情況

采用流式細胞術檢測伯氏瘧原蟲ANKA株感染小鼠的外周血T細胞主要亞群比例及Tim-3的表達情況的變化。結果顯示：與未感染組(0 d組)相比，感染4 d，小鼠外周血CD3+CD4+T細胞比例顯著升高(P<0.001)，在感染第7和第9天又逐漸降低(P<0.001)，在感染第16和第19天逐漸升高(P<0.01)，整體呈先降低后升高的趨勢(圖4A)；與未感染組(0 d組)相比，感染4 d小鼠外周血CD3+CD8+T細胞比例顯著降低(P<0.001)，在感染的第7和第9天又逐漸升高(P<0.001)，在感染的第16和第19天均發生降低(P<0.05、P<0.001)，整體呈先升高后降低的趨勢(圖4B)。如圖4C和圖4D所示，隨感染時間的延長，小鼠外周血Tim-3+CD3+CD4+T細胞和Tim-3+CD3+CD8+T細胞比例均呈先升高后降低的趨勢(P<0.01)，但感染末期Tim-3+CD3+CD4+T細胞和Tim-3+CD3+CD8+T細胞的比例仍顯著高于未感染組(0 d組)。利用流式細胞術檢測的外周血中這兩種細胞表面Tim-3分子的MFI，如圖4E和圖4F所示：Tim-3分子在CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞表面的表達均呈先升高后降低的趨勢，但感染末期Tim-3分子的表達量也均高于未感染組(0 d組)。

A. CD3+CD4+ T細胞比例統計結果；B. CD3+CD8+ T細胞比例統計結果；C. Tim-3+CD3+CD4+ T細胞比例統計結果；D. Tim-3+CD3+CD8+ T細胞比例統計結果；E. Tim-3在CD3+CD4+ T細胞的表達變化；F. Tim-3在CD3+CD8+ T細胞的表達變化

2.4 感染伯氏瘧原蟲不同時期小鼠脾中NK細胞及NK細胞表面Tim-3的表達情況

利用流式細胞術檢測小鼠脾中NK細胞及NK細胞表面Tim-3的變化，圖5A為流式圈門方案。如圖5B所示：與未感染組(0 d組)相比，感染4 d，小鼠脾CD3-NK1.1+細胞比例顯著降低(P<0.001)，感染第11天比例降到最低(P<0.001)，感染第13～19天逐漸升高，但CD3-NK1.1+細胞的比例仍顯著低于未感染組(0 d組)。與未感染組(0 d組)相比，感染4 d，小鼠脾Tim-3+CD3-NK1.1+細胞的比例顯著升高(P<0.01)，感染的第11天比例升到最高(P<0.001)，隨后逐漸降低，但感染后期脾Tim-3+CD3-NK1.1+細胞仍顯著高于未感染組(圖5C)。在感染瘧原蟲后，小鼠脾CD3-NK1.1+細胞細胞表面的Tim-3分子的表達量均顯著高于未感染組(圖5D)。

A. 流式細胞圈門方案； B. CD3-NK1.1+ 細胞比例統計結果；C. Tim-3+CD3-NK1.1+ 細胞比例統計結果；D. Tim-3在CD3-NK1.1+ 細胞的表達變化。*. P<0.05, **. P<0.01, ###、***. P<0.001, *.代表與0 d組進行比較，#.代表19 d組與16 d組進行比較

2.5 感染伯氏瘧原蟲不同時期小鼠外周血中NK細胞及NK細胞表面Tim-3的表達情況

小鼠外周血中CD3-NK1.1+細胞的比例在感染后第4天發生顯著升高(P<0.05)，隨后降低，直至感染末期，且在感染的第9～19天，CD3-NK1.1+細胞的比例均顯著低于未感染組(P<0.001,圖6A)。外周血Tim-3+CD3-NK1.1+細胞的比例在感染后顯著升高(P<0.001，圖6B)。流式細胞術MFI結果顯示：外周血中，CD3-NK1.1+細胞表面Tim-3分子的表達量呈不規則升高趨勢，感染末期升至最高(圖6C)。

A. CD3-NK1.1+ 細胞比例統計結果；B. Tim-3+CD3-NK1.1+ 細胞比例統計結果；C. Tim-3在CD3-NK1.1+細胞的表達變化。*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001, *.代表與0 d組進行比較

2.6 血清中細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10的檢測結果

利用細胞因子微球檢測技術檢測了小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10的分泌情況。如圖7A和圖7F，感染瘧原蟲后的第4天，血清中IFN-γ的分泌急劇增多，且差異極顯著(P<0.001)，之后逐漸降低，直至感染的第13～19天, IFN-γ的分泌量與未感染組幾乎相同(P>0.05)；圖7B和圖7F為血清中IL-2的分泌情況，結果顯示感染瘧原蟲后的第4～19天，血清中IL-2的分泌量均顯著高于未感染組(P<0.05)；如圖7C、圖7D和圖7F所示，感染瘧原蟲后，小鼠血清中IL-6和TNF-α的分泌均出現了先升高后降低的趨勢(P<0.05)。血清中IL-10的含量在小鼠感染瘧原蟲后逐漸升高，且在感染末期達到最高(P<0.001,圖7E、圖7F)。

A～E. 血清中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α和IL-10的檢測結果統計；F. 對血清中IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α和IL-10檢測數據進行的熱圖分析結果。*. P<0.05, **. P< 0.01, ***. P<0.001, *.代表與0 d組進行比較

3 討 論

脾是機體重要的免疫器官，在機體的造血和免疫監視功能中都起著非常重要的作用，脾腫大可能是嚴重疾病的第一個征兆[17]。本研究發現，在感染瘧原蟲第4天小鼠脾腫大非常明顯，且隨感染時間的延長，小鼠脾持續增大。脾的功能之一是清除異常紅細胞，因此，這可能意味著在感染瘧原蟲的小鼠脾中存在更多的受感染紅細胞。此外，本研究發現感染瘧原蟲小鼠脾非淋巴細胞亞群的細胞比例顯著增多，而已有研究表明，脾腫大與非淋巴細胞(例如中性粒細胞)的脾浸潤有關[17]，這也可能是導致本研究中小鼠脾增大的原因之一。

T細胞是清除紅內期瘧原蟲的重要組成部分[5]，可產生如IFN-γ和TNF-α等促炎細胞因子，從而引發巨噬細胞和其他組分的抗寄生蟲免疫應答[7]。本研究顯示,外周血T細胞，尤其是CD3+CD8+T細胞在感染前期顯著升高，而血清中的IFN-γ的分泌量也在此時達到最高。除T細胞外，IFN-γ也可由NK細胞產生，是NK細胞清除瘧原蟲所必需的細胞因子[18]，NK細胞通過細胞毒性和產生促炎細胞因子來破壞受損、功能失調或被感染的宿主細胞，從而控制瘧原蟲感染的進程[9]。本研究發現，感染早期外周血NK細胞的比例也達到了最高。具有抗蟲活性的TNF-α也可通過活化的巨噬細胞分泌[19-20]。IL-2也是一種促炎細胞因子，因其具有促進T細胞體外增殖和分化的能力而被命名為T細胞生長因子(T cell growth factor，TCGF)。IL-2主要由活化的T細胞產生，尤其是活化的CD4+T細胞[21]。IL-6主要由單核巨噬細胞、Th2 細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞等產生，可與 IL-1 一起協同促進 T 細胞增殖，它還可促使 B 細胞分化。瘧原蟲紅內期感染期間，IL-6可以促進CD4+T細胞活化和B細胞應答反應及分化，刺激早期瘧原蟲特異性IgM的產生，是瘧原蟲感染期間免疫應答的重要組成部分[22]。在本研究中，血清IFN-γ、IL-2、IL-6和TNF-α的分泌在感染瘧原蟲后顯著升高，在感染后4、7或9 d達到最高水平，表明機體此時在進行積極的抗蟲免疫反應。

然而，瘧原蟲感染會引起T細胞的耗竭[23]。已有研究表明，在瘧原蟲感染中，表達Tim-3的T細胞亞群比例升高，而阻斷Tim-3可增強宿主介導的細胞免疫應答反應[13]。Tim-3作為一種免疫抑制分子，在包括T細胞、NK細胞、巨噬細胞和單核細胞等多種免疫細胞上均有表達。在對荷瘤小鼠的研究中發現，抗Tim-3抗體可減弱小鼠對抗PD-1治療產生耐藥性[24]。也有研究表明，給感染日本血吸蟲的小鼠注射Tim-3-Fc融合蛋白，表達IFN-γ的CD4+T細胞的比例會增加，表明Tim-3抑制了機體的Th1型免疫反應[11]。本研究發現，在感染瘧原蟲后小鼠脾和外周血T細胞和NK細胞表達的Tim-3的水平均出現升高趨勢，雖然Tim-3分子在外周血CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞表面的表達均呈現了先升高后降低的趨勢，但感染末期Tim-3分子的表達量仍高于未感染小鼠。有研究表明，Tim-3在抑制細胞因子(如TNF和 INF-γ)的表達方面也發揮著關鍵作用[25]。在多發性硬化和結腸直腸癌的小鼠模型中，Tim-3和IL-10的升高伴隨著IFN-γ和TNF-α表達的減少[26]。此外，由Th2細胞產生的IL-10也可抑制IL-2、IL-12和IFN-γ的分泌，并降低樹突狀細胞的抗原提呈和MHC Ⅱ 類分子表達[27]。也有研究發現，在約氏瘧原蟲感染的小鼠中，IL-10和TGF-β的產生與高寄生蟲血癥和嚴重貧血有關[28]。在本研究中，Tim-3分子的持續升高表達以及血清中IL-10的急劇持續升高可能是引起IFN-γ、TNF-α和IL-6在感染中期和后期逐漸降低的原因之一。表明感染后期，機體的免疫抑制過程加劇，這也可能是機體免疫反應最終未能成功殺滅瘧原蟲的原因之一。

4 結 論

綜上，本研究結果表明，感染瘧原蟲后，小鼠的T細胞與NK細胞介導的免疫應答反應發揮了一定的殺傷作用，在感染前期有一些促炎細胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-6參與了抗瘧原蟲免疫，但由于Tim-3免疫檢查點分子及一些發揮免疫抑制作用的細胞因子(IL-10)的過度表達，推測這可能導致小鼠在感染后期處于過度的免疫抑制狀態，從而有利于瘧原蟲逃避宿主的免疫捕殺作用。這提示從宿主免疫抑制角度出發，針對抗瘧原蟲免疫反應方面設計藥物具有重要意義。