關中奶山羊源D型產氣莢膜梭菌全基因組序列測定及其分子特征分析

吳 克，馮 航，王 娟，楊增岐

(西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是桿菌科、梭菌屬的一種革蘭陽性厭氧菌[1]，可廣泛存在于人類和動物腸道以及食物、河流和土壤等多種自然環境中[2]。作為一種常見的條件性致病菌，產氣莢膜梭菌因能夠導致多種疾病、造成較大畜牧經濟損失和公共衛生安全危害而被廣泛關注[3]。正常條件下，產氣莢膜梭菌在人和動物腸道中存在但并不致病，但當外界環境突變時其能夠迅速繁殖并產生20余種蛋白性毒素并侵襲機體，導致機體發生氣性壞疽和多種胃腸道疾病[4]。根據對CPA、CPB、ETX、ITX、CPE和NetB 6種毒素的產生能力，產氣莢膜梭菌被分為A～G 7個毒素型[5]。

D型產氣莢膜梭菌能夠引起山羊、綿羊和牛等多種動物的腸毒血癥，造成腹瀉和猝死等多種癥狀，對反芻動物的規模化飼養帶來巨大經濟損失[6]。D型產氣莢膜梭菌產生的毒素ETX是由位于質粒上的毒素基因etx編碼、分子量大小為33 ku的穿孔毒素[7]。ETX被認為是毒性最強的產氣莢膜梭菌毒素，毒性僅次于肉毒毒素和破傷風毒素[8]，能夠作用于腸道、腎和肝多種器官，導致包括猝死在內的多種癥狀[9]；并且ETX還能夠和神經細胞結合，造成神經遞質異常釋放從而導致機體神經系統疾病[10]。此外，產氣莢膜梭菌能夠引起人類食源性感染[11]，據相關機構統計，產氣莢膜梭菌引起的食物中毒在美國和韓國食源性感染中排名第2位，在英國和法國則排在第3位[12]。

關中奶山羊是由薩能奶山羊和陜西本地山羊雜交后獲得的新品種，是我國奶山羊中的優良品種。本試驗對采集自腹瀉關中奶山羊的肛門拭子進行了產氣莢膜梭菌的分離鑒定并對分離到的5株D型產氣莢膜梭菌進行了全基因組序列測定分析。本研究系我國首次對D型產氣莢膜梭菌基因組進行研究，對產氣莢膜梭菌疾病的防控及D型產氣莢膜梭菌基因組的后續研究具有重要參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 肛門拭子樣品于2021年下旬采集自陜西省富平縣某規模化關中奶山羊養殖場6只精神沉郁、伴有不同程度腹瀉的奶山羊。樣品采集后置于運輸培養基并保存于4 ℃采樣箱，12 h內送回西北農林科技大學獸醫傳染病實驗室進行細菌分離鑒定。

1.1.2 主要試劑儀器 細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；2×Taq PCR StarMix為北京Genstar生物科技有限公司產品；胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸(TSC)培養基、厭氧肉肝湯培養基、CAMHB肉湯和普通營養瓊脂購自青島海博生物技術有限公司；厭氧培養箱為上海新苗醫療器械制造有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 產氣莢膜梭菌分離鑒定 將所采集的肛門拭子接種于5 mL厭氧肉肝湯培養基，37 ℃溫箱靜置培養18 h增菌。培養完成后，取1 mL菌液3 000 r·min-1離心2 min，并劃線接種于TSC培養基，置于厭氧培養箱37 ℃培養24 h。挑取TSC培養基上黑色菌落，接種于5%綿羊血平板培養基，進行進一步分離純化；挑取血平板上帶有雙重溶血環的單菌落，生理鹽水稀釋煮菌后，PCR擴增分離菌株16S rRNA序列，并送至西安擎科澤西生物技術有限公司序列測定。

1.2.2 分離菌株毒素分型 毒素基因cpa、cpb、etx、itx、cpe、netB的特異引物見表1[5]，由西安擎科澤西生物技術有限責任公司合成。水煮法提取菌株DNA，毒素基因cpa、cpb、etx、itx采用多重PCR, 50 μL體系：25 μL 2×Mix預混液，cpa、cpb、etx、itx毒素上下游引物各1 μL， DNA模板1 μL,雙蒸水補至50 μL。反應程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，51.6 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,30個循環；72 ℃ 10 min。cpe、netB采用單重PCR，20 μL體系：10 μL 2×Mix預混液，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水補至20 μL。反應程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min, 30個循環；72 ℃ 10 min。

表1 毒素基因PCR引物

1.2.3 分離菌株全基因組序列測定及分析 將分離菌株接種于厭氧肉肝湯中過夜培養，無菌條件下取過夜培養菌液3 mL，25 ℃ 12 000 r·min-1離心2 min，按照細菌DNA提取試劑盒流程提取分離菌株DNA，并送至金唯智生物科技有限公司進行全基因組序列測定。分離菌株基因組序列注釋在Rapid Annotations using Subsystem Technology (RAST) (http://rast.nmpdr.org/)上完成；MLST分型通過PubMLST (https://pubmlst.org/) 完成，耐藥基因、毒素基因和插入序列分別通過ResFinder 4.1 (https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/)，ISfinder (https://www-is.biotoul.fr/)，Virulence Factor Database (http://www.mgc.ac.cn/VFs/) 和本地blast進行檢測。基因序列信息和基因環境的對比分析通過Snapgene 4.2.4和Easyfig 2.1實現。

2 結 果

2.1 細菌分離鑒定及毒素分型

分離菌株在37 ℃厭氧條件下培養24 h后，在TSC平板上為中心黑色邊緣半透明中等大小菌落(圖1A)，5%綿羊血平板培養基上為帶有雙重溶血環的半透明光滑較小菌落(圖1B)。PCR擴增分離菌株16S rRNA序列后比對顯示，其與參考產氣莢膜梭菌菌株ATCC13124的16S rRNA序列相似度均達99%以上，綜合判定分離菌株均為產氣莢膜梭菌。毒素分型顯示，5株產氣莢膜梭菌分離株均為D型產氣莢膜梭菌(cpa+，etx+)，根據菌株分離年份和毒素型將分離到的5株D型產氣莢膜梭菌命名21-D-1、21-D-2、21-D-3、21-D-4和21-D-5；其中，菌株21-D-5中檢測食源性致病毒素基因cpe。

圖1 分離菌株21-D-1在TSC平板(A)和5%綿羊血平板(B)上菌落形態觀察

2.2 分離菌株基因組信息

5株D型產氣莢膜梭菌分離株基因組序列已上傳至NCBI數據庫(Bioproject：PRJNA811729)；分離菌株的基因組大小為3 403 167～3 570 770 bp，平均每個基因組中含有3 298個基因編碼區(CDS)，且基因組序列GC含量穩定于28.0%～28.1%(表2)。多位點序列分析(MLST)顯示，21-D-1、21-D-2、21-D-3、21-D-4和21-D-5屬于3個不同的ST型，21-D-1/21-D-2、21-D-3/21-D-4和21-D-5的等位基因組合分別為129-5-1-1-8-19-4-1、37-134-81-34-8-19-1-8和153-94-86-11-90-7-2-140。5株D型產氣莢膜梭菌分離株中共檢測到15種毒素基因，其中，cpa、etx、pfoA、colA、cloSI、nanH、nagK、nagI、nagJ、nanI、nanJ、cpb2和nagH在5株D型產氣莢膜梭菌中均被檢測到，nagL在21-D-1、21-D-2和21-D-5中檢測到，而cpe僅在21-D-5中被檢測到(表3)。除毒素基因外，分離菌株的基因組序列中還檢測到9種耐藥基因，包括四環素類耐藥基因tetA(P)和tetB(P)、氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)-aph(2″)、林可霉素抗性基因lnu(P)； 大環內酯類耐藥基因erm(A)、erm(B)和erm(Q)、氟苯尼考耐藥基因fexA和惡唑烷酮耐藥基因optrA, 并且這9中耐藥基因均在21-D-5的基因組中被檢測到(表4)。

表2 D型產氣莢膜梭菌基分離株基因組信息

表3 D型產氣莢膜梭菌分離株毒素基因匯總

表4 D型產氣莢膜梭菌分離株耐藥基因檢測

2.3 毒素基因etx序列保守性及基因組單核苷酸多態性分析

選取NCBI數據庫中B型產氣莢膜梭菌(ATCC3626)和D型產氣莢膜梭菌(NCTC8503)etx序列作為參考對本研究中D型產氣莢膜梭菌毒素基因etx序列的保守性進行評估。結果顯示(表5)，毒素基因etx序列在本研究新分離到的D型產氣莢膜梭菌和參考序列之間保守性較強(99.8%～100%)，僅在第51位核苷酸(由C-G變為G-C)和726位核苷酸(由G-C變為A-T)處存在差異，且不影響對應位置絲氨酸的編碼。

表5 分離菌株毒素基因etx序列與參考etx序列對比

選取NCBI數據庫中D型產氣莢膜梭菌NCTC8503 (NCBI BioSample: SAMEA3879480), JGS1721 (NCBI BioSample: SAMN02436277), IQ1 (NCBI BioSample: SAMEA5818795)基因組序列與本研究新分離的D型產氣莢膜梭菌基因組進行單核苷酸多態性(SNPs)分析。結果表明，21-D-1和21-D-2以及21-D-3和21-D-4之間的SNPs差異很小(< 25)，而21-D-1/21-D-2，21-D-3/21-D-4與其他菌株之間的SNPs則在16 440～21 943不等。依照SNPs構建的進化樹顯示，21-D-1和21-D-2，21-D-3和21-D-4之間的進化關系最為相近，其次為21-D-5，最后為分離自其他國家的參考菌株NCTC8503、JGS1721和IQ1(圖2)。

圖2 D型產氣莢膜梭菌分離菌株及參考株之間SNPs差異及進化關系

2.4 毒素基因etx及耐藥基因optrA基因環境分析

選取SNPs分析中使用的D型產氣莢膜梭菌菌株與本研究分離到的D型產氣莢膜梭菌對毒素基因etx的基因環境進行分析。結果顯示，etx基因環境在菌株21-D-1、21-D-2、21-D-3、21-D-4、NCTC8503、JGS1721和IQ1中一致，均為移動元件-插入序列IS1151-etx-轉座酶編碼基因-插入序列ISCp1；但在分離株21-D-5中etx的下游額外檢測到了插入序列IS1151、毒素基因cpe和一些假定蛋白編碼基因hp；并且序列分析顯示，分離株21-D-5中etx上下游插入序列IS1151與21-D-1～21-D-4中etx上游插入序列IS1151序列相似度較低，為92%～93%(圖3)。

圖3 D型產氣莢膜梭菌菌株及參考D型產氣莢膜梭菌菌株etx基因環境分析

對2020年和2022年我國報道的攜帶有噁唑烷酮類耐藥基因optrA的產氣莢膜梭菌菌株(2C45，QHY-2)[13-14]，與本研究菌株21-D-5進行optrA基因環境分析顯示，optrA基因環境在產氣莢膜梭菌菌株2C45、QHY-2和21-D-5之間高度相似，均為ISVlu1-IS1216-erm(A)-optrA-IS1216-fexA-ISVlu1(圖4)；表明攜帶耐藥基因erm(A)、optrA和fexA的DNA區段可能作為一個可移動元件在產氣莢膜梭菌菌株間進行傳播。

圖4 菌株21-D-5和參考產氣莢膜梭菌菌株optrA基因環境

3 討 論

關中奶山羊為陜西關中地區的乳用型山羊，具有適應性廣、耐粗飼、繁殖率高、適于放牧或舍飼、乳用性能好等優點。D型產氣莢膜梭菌與多種動物的胃腸道疾病密切相關，尤其是綿羊和山羊的腸毒血癥。本研究自6份腹瀉關中奶山羊肛拭子樣品中分離到5株D型產氣莢膜梭菌，表明該場區關中奶山羊正在遭到D型產氣莢膜梭菌侵襲。結合產氣莢膜梭菌分離情況和羊伴有精神沉郁和腹瀉癥狀、可初步判定此次奶山羊腹瀉與D型產氣莢膜梭菌相關；但由于未檢測糞便中是否含有毒素ETX，無法確證關中奶山羊的腹瀉是由分離到的D型產氣莢膜梭菌菌株引起。

全基因組序列測定分析能夠從基因水平闡述病原菌毒性和耐藥性等特征，對細菌性疾病的精準防控和治療具有參考意義。全基因組序列測定顯示分離的D型產氣莢膜梭菌基因組大小、編碼基因數量和GC含量等特征穩定；并且分離株21-D-1/21-D-2和21-D-3/21-D-4基因組之間SNPs差異極小，表明分離株21-D-1/21-D-2和21-D-3/21-D-4可能分別屬于兩株不同的產氣莢膜梭菌菌株、D型產氣莢膜梭菌菌株可能在關中奶山羊之間具有一定程度的傳播。

不同菌株間etx序列及基因環境比對顯示，該基因在不同D型產氣莢膜梭菌中的核苷酸序列相似度極高、擁有完全一致的氨基酸編碼序列；且在不同D型產氣莢膜梭菌中的基因環境基本一致，一定程度表明不同D型產氣莢膜梭菌菌株產生的ETX毒性相近。插入序列(ISs)位于復合型轉座子的末端，能夠將基因組片段從供體細菌的基因組切割并將其連接到受體細菌的基因組當中，從而造成包括耐藥基因和毒素基因在內的多種基因的傳播[15]。本研究在毒素基因etx的上下游分別發現插入序列IS1151和ISCp1，表明etx可能通過IS1151和ISCp1的介導進行轉移。除毒素基因etx外，分離株21-D-5中還檢測到食源性致病毒素基因cpe，基因環境分析顯示，其位于毒素基因etx下游，表明在菌株21-D-5中毒素基因etx和cpe能夠位于同一毒素質粒。

動物源細菌耐藥性的增強不僅給畜牧經濟效益帶來了較大的危害，對人類健康也具有一定威脅[16]。本研究中，耐藥基因optrA和其他多種耐藥基因均在產氣莢膜梭菌分離株21-D-5中被檢測到，耐藥基因optrA基因通過編碼一種ATP結合蛋白導致噁唑烷酮類抗生素的耐藥性[14]。作為一類新型非獸用抗生素，噁唑烷酮類耐藥基因在關中奶山羊源產氣莢膜梭菌中的出現一定程度揭示了耐藥基因optrA在人和動物源細菌之間的傳播。通過對optrA基因環境的進一步分析，插入序列IS1216位于erm(A)-optrA的兩側，且插入序列ISVlu1位于erm(A)-optrA-fexA的兩側；進一步佐證了耐藥基因optrA的傳播，并揭示了optrA在不同菌株間可能以IS1216-erm(A)-optrA-IS1216和ISVlu1-IS1216-erm(A)-optrA-IS1216-fexA-ISVlu1這兩種形式進行轉移。合理使用抗生素是減少耐藥菌數量、防止相應耐藥基因傳播的重要方法，但多種耐藥基因的共同傳播會造成多重耐藥，對抗生素使用帶來挑戰。

本研究為國內首次對D型產氣莢膜梭菌基因組進行序列測定分析，在描述D型產氣莢膜梭菌基因組特征的基礎上，通過對相應毒素基因及耐藥基因的序列分析在基因水平揭示了其特征和傳播的可能性。除此之外，該研究發現了同時攜帶腸毒血癥關鍵毒素基因etx、人類食源性感染關鍵毒素基因cpe和多種耐藥基因的D型產氣莢膜梭菌菌株21-D-5。毒素基因cpe在引起人類食物中毒的產氣莢膜梭菌菌株中普遍存在，達96.3%(105/109)，與人類食源性疾病密切相關[17]。像21-D-5這種攜帶有多種重要毒素和耐藥基因的產氣莢膜梭菌菌株，其流行無疑會對公共衛生安全造成較大的威脅；在畜牧生產中應規范對抗生素的使用、加強飼養管理及環境消殺，以防止產氣莢膜梭菌耐藥性的增強及其在動物和人類之間的傳播致病。

4 結 論

自腹瀉奶山羊肛門拭子分離到5株D型產氣莢膜梭菌(21-D-1～21-D-5)，全基因組序列測定顯示，5株菌基因組大小、GC含量和基因數量穩定；單核苷酸多態性(SNPs)分析顯示，21-D-1和21-D-2以及21-D-3和21-D-4大概率屬于相同的產氣莢膜梭菌菌株。毒素基因檢測表明，其均為攜帶etx的D型產氣莢膜梭菌，且發現21-D-5同時攜帶腸毒血癥關鍵毒素基因etx、人類食源性感染關鍵毒素基因cpe和多種耐藥基因。