宿主膜聯蛋白A2與偽狂犬病病毒US3蛋白互作及其對細胞凋亡的影響

郭振華，李 翔，翁茂洋，金前躍，郭軍慶，邢廣旭，張改平,,3*

(1.河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002； 2.西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)是具有囊膜的雙鏈DNA病毒，基因組大小約140 kb，編碼至少70個蛋白，屬于α-皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)，水痘病毒屬(Varicellovirus)[1]。豬是PRV的唯一自然宿主，PRV感染豬后引起的疾病稱為偽狂犬病(pseudorabies, PR)，常見的臨床表現包括母豬繁殖障礙、仔豬神經癥狀以及中大豬呼吸道癥狀等[2-3]。PRV在我國豬群中具有較高的流行率，是危害我國養豬業的重要病原之一。此外，PRV還可感染狗、貓、牛、羊、狐貍、水貂和狼等多種動物，具有很廣的感染譜，且除了豬以外，其他動物多在感染后24～48 h內死亡[4]。

US3 蛋白是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于所有的α-皰疹病毒亞科成員中，也是PRV的一個重要毒力蛋白[5]。研究顯示，US3可以誘導絲切蛋白(cofilin)去磷酸化和RhoA 蛋白的磷酸化，從而影響細胞骨架重排[6-7]；可以通過降解Bcl-2 相關轉錄因子1(Bcl-2 associated transcription factor 1，Bclaf1)和誘導IRF3 的高度磷酸化來抑制Ⅰ型干擾素信號[8]；通過激活PI3-K/Akt和NF-κB 信號通路來調控抗凋亡基因的表達等[9]。但目前對US3參與的生物學過程及其分子機理的揭示還很有限，有必要深入發掘鑒定新的和US3互作的宿主蛋白，從而進一步拓展對US3 生物學功能的認知。

膜聯蛋白A2(annexin A2，ANXA2)是一個具有多種生物學功能的鈣磷脂結合蛋白，參與囊泡轉運、細胞骨架膜動力學和信號轉導等多個生物學過程[10-11]。在病毒感染過程中也發揮著重要作用，有報道顯示，ANXA2可以和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的Nsp9互作，從而促進PRRSV在MARC-145細胞上的增殖[11]；ANXA2還可以和宿主波形蛋白(vimentin)互作，來促進PRRSV和豬圓環病毒2型(PCV2)的復制[12]；ANXA2可以和豬瘟病毒(CSFV)NS5A和E2蛋白互作，促進CSFV在PK-15細胞上的增殖[13]。但目前尚沒有針對ANXA2是否影響PRV復制增殖的相關研究報道。

本研究中，作者通過免疫共沉淀和pull-down分析驗證了US3和ANXA2的相互作用，發現抑制ANXA2的表達可以顯著影響PRV的增殖，過表達ANXA2對PRV和凋亡刺激劑誘導的細胞凋亡具有負調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

PK-15細胞和3D4/21細胞由本實驗室保存；PRV毒株HeNLH/2017(GenBank：MT775883)由本實驗室從臨床病料中分離鑒定[3]；小干擾RNA由上海吉瑪公司合成，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；pEGFP-C1、pEGFP-N1和pCMV-3xflag質粒由本實驗室保存；pEGFP-US3、pEGFP-ANXA2、pCMV-3xflag-US3、pCMV-3xflag-A2和pEASY-Blunt-UL54重組質粒由本實驗室構建并保存；Flag親和磁珠購自ThermoFisher Scientific公司，GFP-Trap磁珠購自ChromTek公司；PRV gE蛋白單克隆抗體由本實驗室制備、保存。

1.2 試劑

無內毒素質粒提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；Q5超保真酶和限制性內切酶購自NEB公司；核酸提取試劑Mini Best Virus DNA/RNA Extraction kit和反轉錄試劑Prime ScriptTMRT reagent kit購自TaKaRa公司；TRIzolRReagent購自索萊寶生物科技有限公司；RIPA細胞裂解液和細胞凋亡刺激劑(apoptotic stimulator)購自碧云天生物技術公司；ECL超敏化學發光液(P10300)購自新賽美公司；SYBR Green熒光定量試劑購自Roche公司；ProteoSilverTMStain Kit銀染試劑購自Sigma公司；GFP抗體(D5.1)、ANXA2抗體(D11G2)、Caspase-3抗體和Cleaved Caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology公司；Flag抗體和β-tubulin抗體購自Abbkine公司；AnnexinV-APC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司。

1.3 US3潛在互作蛋白發掘

pEGFP-N1和pEGFP-US3分別轉染PK-15細胞，24 h后收取蛋白樣品，并用GFP-Trap磁珠進行pull-down，制備的蛋白樣品跑SDS-PAGE，按照 ProteoSilverTMStain Kit銀染試劑的說明書進行銀染，待加入終止液后，在白色背景板下比較銀染后的pEGFP-N1和pEGFP-US3組的樣品條帶，用干凈刀片切取差異性條帶，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行LC-MS質譜分析。

1.4 免疫共沉淀和pull-down分析

pEGFP-ANXA2、pEGFP-N1、pCMV-3xflag和pCMV-3xflag-US3分別進行兩兩組合，轉染HEK 293T細胞，轉染36 h后，用Flag親和磁珠和GFP-Trap磁珠分別進行免疫共沉淀分析。取pCMV-3xflag和pCMV-3xflag-US3質粒轉染PK-15細胞，36 h后收取蛋白樣品，用Flag親和磁珠進行pull-down，用ANXA2和Flag抗體進行免疫印跡分析。

1.5 熒光定量RT-PCR

利用TRIzolR法分別提取RNAi對照組和處理組細胞的總RNA，然后進行反轉錄獲得cDNA，以獲得的cDNA為模板，通過檢測ANXA2和內參基因GAPDH的mRNA含量來驗證ANXA2在轉錄水平的敲低效果；利用絕對熒光定量PCR評估敲低ANXA2的表達對PRV基因組復制的影響，按照病毒DNA/RNA提取試劑盒的說明書進行RNAi對照組和處理組病毒核酸的提取。然后以pEASY-Blunt-UL54質粒標準品建立標準曲線，用建立的針對PRVUL54基因的熒光定量PCR進行擴增，并根據標準曲線計算基因的拷貝數，用來代表各組中PRV DNA的含量。具體的引物和siRNA序列見表1。

表1 引物和siRNA序列信息

1.6 病毒滴度測定

采用半數細胞培養物感染量(50% tissue culture infective dose，TCID50)來進行測定，將PK-15 細胞以1.0 ×104個細胞·孔-1鋪于 96 孔板，待每個孔的單層細胞長至 90%的豐度時，棄去上清培養基，用PBS潤洗3次；然后加入用DMEM細胞維持液(含2.0%FBS)10倍倍比稀釋的病毒液樣品，獲得稀釋度依次為 10-1～10-10的待測病毒稀釋液；96 孔板的第一列對應 10-1稀釋度的混合液，第二列對應10-2稀釋度的混合液，依次類推，最后兩列作為空白組，加入無病毒液的維持液，每個稀釋度設8個重復。置于細胞培養箱，培養3～5 d，期間在顯微鏡下觀察PRV感染引起的細胞病變情況，記錄每個稀釋度發生細胞病變的孔數，用 Reed-Muench 法計算TCID50。

1.7 Western blot分析

利用RIPA細胞裂解液收取細胞蛋白樣品，制備的蛋白樣品經變性處理后，取適量加到12.0%變性蛋白預制膠上樣孔中進行電泳(SDS-PAGE)，然后經過轉印將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，用5.0%的脫脂奶粉(0.5%PBST配制)對膜進行室溫封閉2 h，接著分別用特異性的一抗或二抗(見“1.2”)繼續室溫孵育1 h，最后將配制的ECL超敏化學發光液均勻加到PVDF膜上，置于凝膠成像掃描儀調整合適的曝光時間進行觀察。

1.8 流式細胞術

PRV感染或者凋亡刺激劑刺激PK-15細胞，在指定時間點收取細胞，并用PBS進行懸浮，按照說明書用Annexin V-APC/PI對細胞進行避光染色5 min，然后使用Beckman CytoFLEX設備進行流式細胞檢測分析，所有數據使用CytExpert軟件進行分析處理。

1.9 數據統計

熒光定量PCR/RT-PCR、病毒滴度測定和細胞凋亡的流式分析試驗均進行了3次重復，各組數據用GraphPad Prism軟件中的t檢驗或者ANOVA方法進行統計學差異性分析。P<0.05(*)表示差異顯著，P<0.01(**)表示差異極顯著，ns表示無顯著差異。

2 結 果

2.1 US3潛在互作蛋白篩選

通過蛋白pull-down、銀染和串聯質譜(LC-MS)分析，發現了多個與PRV US3蛋白具有潛在相互作用的宿主蛋白(表2)。

表2 LC-MS質譜分析結果

2.2 ANXA2與PRV US3的相互作用

pEGFP-ANXA2與pCMV-3xflag-US3，pEGFP-N1與pCMV-3xflag-US3，pEGFP-ANXA2與pCMV-3xflag分別共轉染HEK 293T細胞，收取蛋白樣品后，用Flag親和磁珠或GFP-Trap磁珠分別進行免疫共沉淀分析。結果如圖1所示，Flag親和磁珠進行免疫沉淀分析時，可以檢測到特異的GFP-ANXA2條帶(圖1A)；GFP-Trap磁珠進行免疫沉淀分析時，可以檢測到特異性的Flag-US3條帶(圖1B)。進一步用pCMV-3xflag和pCMV-3xflag-US3質粒轉染PK-15細胞，36 h后收取蛋白樣品，用Flag親和磁珠進行pull-down，分別用ANXA2和Flag抗體進行免疫印跡分析，結果顯示，US3可以和內源性的ANXA2發生特異的相互作用(圖1C)。

A、B.免疫共沉淀驗證外源性ANXA2和US3的互作；C.Pull-down分析US3和內源性ANXA2的互作

2.3 敲低ANXA2的表達抑制PRV的增殖

PK-15細胞轉染小干擾RNA 36 h后，用相對熒光定量PCR和免疫印跡法檢測ANXA2轉錄和表達的抑制效果，結果如圖2A和B所示，Si ANXA2-670#序列對的基因沉默效果最好，選擇該序列進行后續的試驗。為進一步驗證ANXA2對PRV增殖的影響，PK-15細胞轉染Si NC和Si ANXA2-670# 36 h后，用PRV進行感染(MOI=0.1)，在指定的時間點收取樣品，通過分析基因拷貝數、病毒滴度和gE蛋白的表達水平(圖2C～E)，結果發現，與Si NC組相比較，敲低ANXA2的表達后顯著抑制了PRV在PK-15細胞上的復制增殖。

A、B. qRT-PCR和免疫印跡評估ANXA2的敲低效果；C. 病毒基因含量的檢測；D. 病毒滴度(TCID50)的檢測；E. 病毒蛋白表達水平分析；*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001, ns. P>0.05

2.4 PRV感染可以誘導細胞凋亡

細胞凋亡是宿主細胞抵抗各種病原微生物感染的關鍵防御機制，作者分析了PRV感染對細胞凋亡的影響。結果如圖3所示，3D4/21細胞(圖3A)和PK-15細胞(圖3B)感染PRV(MOI=0.1)的指定時間點收集蛋白樣品，通過免疫印跡檢測顯示，與對照組相比，凋亡效應蛋白Caspase-3發生了明顯的活化剪切；進一步的利用流式細胞儀檢測Annexin V和PI染色細胞情況，發現PRV感染后，Annexin V和PI雙染的晚期凋亡細胞明顯增多(圖3C)。這些結果表明，PRV感染宿主細胞后會誘導細胞凋亡的發生。

A、B. Western blot分析caspase-3剪切體蛋白水平的變化；C. 流式細胞術分析細胞凋亡情況

2.5 ANXA2參與了PRV誘導的細胞凋亡調控

有研究報道ANXA2可以抵抗X射線輻射誘導的細胞凋亡[14]，但ANXA2是否參與了病毒感染誘導的細胞凋亡調控尚不清楚。在PK-15細胞上分別過量或敲低ANXA2的表達，然后用PRV進行感染(MOI=0.1)24 h，收取蛋白樣品進行免疫印跡分析。其中PRV US3蛋白是已知的具有抑制細胞凋亡的作用，作為陽性對照。結果顯示，在過表達ANXA2的條件下(圖4A)，ANXA2對PRV誘導的細胞凋亡顯示出了明顯的抑制效應；而敲低ANXA2的表達后(圖4B)，則對PRV誘導的細胞凋亡具有顯著的促進作用。

A. 過表達ANXA2抑制PRV感染誘導的細胞凋亡；B. 敲低ANXA2的表達促進PRV感染誘導的細胞凋亡

2.6 ANXA2對凋亡刺激劑誘導細胞凋亡的影響

為進一步驗證ANXA2對細胞凋亡的影響，同樣在過表達或敲低ANXA2表達的條件下，用凋亡刺激劑刺激PK-15細胞10 h，然后收集樣品用對應的抗體進行免疫印跡分析。結果如圖5A和B所示，ANXA2對凋亡刺激劑誘導的細胞凋亡具有顯著的抑制作用。

A. 過表達ANXA2抑制凋亡刺激劑誘導的細胞凋亡；B. 敲低ANXA2的表達增強凋亡刺激劑誘導的細胞凋亡

2.7 流式細胞術分析ANXA2對細胞凋亡的影響

PK-15細胞在ANXA2敲低或過表達的條件下，用凋亡刺激劑刺激2 h后，收取細胞用Annexin V-APC/PI凋亡檢測試劑盒對細胞進行染色，然后進行流式細胞儀檢測。結果如圖6A和B所示，敲低ANXA2的表達對凋亡刺激劑誘導的細胞凋亡呈現出促進效應，而過表達ANXA2的條件下，則表現出顯著的抑制細胞凋亡的效應。

A. 過表達ANXA2抑制凋亡刺激劑誘導的細胞凋亡；B. 敲低ANXA2的表達增強凋亡刺激劑誘導的細胞凋亡。**.P<0.01

3 討 論

US3蛋白激酶是一個在α皰疹病毒中高度保守的蛋白，已有的研究顯示US3蛋白參與了細胞骨架重排、免疫調控和細胞凋亡等多個生物學過程，是PRV進入細胞后的入核和出核過程的重要調控蛋白[8,15-16]。關于US3互作蛋白的篩選鑒定將有助于更好地理解US3蛋白的生物學功能，如Jansens等[5]利用磷酸化組學分析了過表達US3的條件下對宿主蛋白磷酸化的影響，鑒定發現了14個顯著去磷酸化的蛋白和64個顯著磷酸化的蛋白。在前期試驗中，通過在PK-15細胞過表達GFP-US3蛋白，然后利用GFP-Trap磁珠pull down，結合銀染和蛋白質譜技術(LC/MS)，發現宿主ANXA2是一個潛在的與US3互作蛋白。在本研究中，作者通過免疫共沉淀技術和pull-down技術進一步驗證了ANXA2和US3的相互作用。ANXA2作為一個新鑒定的和US3互作的宿主蛋白，拓展了對US3蛋白作用底物的認識，其具體行使的生物學功能及分子機制還有待進一步深入研究。

ANXA2在PRV感染過程中的作用尚不清楚。有研究顯示，PRV感染神經細胞后，可以刺激軸突處局部的蛋白合成，豐度較高的蛋白有ANXA2 和外周蛋白 (peripherin)，這些蛋白參與了PRV在神經細胞的逆向轉運過程[17]。在對PRV病毒粒子包含宿主蛋白成分的鑒定研究中，也發現了ANXA2存在于成熟的病毒粒子中[18]。本研究中，作者利用小RNA干擾技術來抑制ANXA2的表達，發現敲低ANXA2的表達，可以顯著抑制PRV在PK-15細胞上的復制增殖。結果提示ANXA2在PRV復制增殖的過程中發揮著一定的作用。

細胞凋亡是宿主細胞抵抗各種病原微生物感染的重要防御機制之一[19-20]。有報道顯示，US3可以通過激活PI3-K/Akt和NF-κB 信號通路來抑制PRV感染誘導的細胞凋亡[9]；而也有報道顯示，在P53基因誘導的凋亡過程中，ANXA2的表達受到顯著抑制，ANXA2也可以抵抗X射線誘導的細胞凋亡[10]。本研究中，作者通過免疫印跡和流式細胞術，驗證了過表達ANXA2對PRV和凋亡刺激劑誘導的細胞凋亡的影響，確定了ANXA2具有負調控細胞凋亡的作用，但其具體的分子機制尚需要進一步的研究證實。

4 結 論

ANXA2是一個新的可以和PRV US3蛋白相互作用的宿主蛋白，PRV的復制增殖需要ANXA2的參與，ANXA2具有負調控細胞凋亡的作用。