不同類型肉雞線粒體單倍型與遺傳起源研究

唐修君，樊艷鳳，賈曉旭，葛慶聯，陸俊賢，周 倩，陳大偉，高玉時*

(1.中國農業科學院家禽研究所，揚州 225015； 2.南京農業大學動物科技學院，南京210095；3.江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，揚州 225125)

線粒體DNA由于其母系遺傳、獨立的核外遺傳密碼以及進化速率快等獨有特性，廣泛被用于探討物種遺傳結構、系統進化及種質資源鑒定研究[1-3]。線粒體D-loop區又稱D-環區，為線粒體DNA中的一段非編碼區，它是線粒體基因組序列上變異最大的區域，被作為理想的分子標記用來研究親緣關系較近群體的遺傳起源和種質鑒定[4-7]。迄今為止，在雞[8]、山鷓鴣[9]、鴿[10]、鴨[11]、豬[12-13]、牛[14-15]、羊[16-17]、馬[18-19]、驢[20-21]、鹿[22]和小鼠[23]等諸多物種的遺傳多樣性和系統發育研究中已被成功應用。在我國，將線粒體D-loop區作為目標位點應用于地方雞種遺傳多樣性和母系起源研究已成為科研熱點[24-27]。然而其中針對線粒體優勢單倍型與雞生產性能相關性的研究甚少。1985年，Bell等[28]研究顯示，由線粒體DNA遺傳效應引起的細胞質效應會影響奶牛的生產性能指標，主要包括乳脂率和產奶量等。Toelle等[29]研究發現，細胞質母系效應對杜洛克豬和約克夏豬初生重、斷奶重和背膘厚度等均有重要影響。Mannen等[30]研究發現，線粒體16sRNA的2 232 bp處的堿基替換可作為日本黑牛肉質性狀的重要候選基因?？梢?，線粒體遺傳效應對動物生產性能具有重要影響。

經研究顯示，線粒體D-loop區遺傳多樣性和單倍型比例在雞母本和后代個體中嚴格遵循母系遺傳[31]。然而，自達爾文提出家雞的祖先為紅色原雞以來，家雞的母系起源問題至今還沒有明確定論。1994年，Fumihito等[32]研究顯示，家雞唯一起源于分布于泰國東部及其周邊地區的原雞指名亞種。2008年，Kanginakudru等[33]揭示了分布于印度及其周邊地區的原雞印度亞種和滇南亞種，其在家雞馴化和選育過程中也發揮了重要的作用。2020年，Wang等[34]基于全基因組測序技術，系統地比較了來自于亞洲和歐洲的大量雞種、4種原雞以及紅色原雞5個亞種共計863份樣品，分析并提出了家雞可能的起源地以及馴化要地。作為伴隨人類農業文明起源和發展的重要家禽，從源頭上查清我國地方雞的起源馴化和進化關系，對當前品種的保護規劃以及開發利用具有現實意義。

本研究擬通過研究不同類型肉雞生長性能情況和線粒體單倍型特性，分析線粒體優勢單倍型與肉雞生長速度的相關性；同時通過與紅色原雞序列的聚類分析，探討不同雞種母系起源，研究結果將為肉雞配套系選育提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇6個不同類型肉雞品種(配套系)為研究對象(表1)，其中快大型白羽肉雞品種2個，分別為AA肉雞和羅斯308；黃羽肉雞品種4個，根據不同生長速度分類，分為中快速型黃羽肉雞配套系2個(禽雁麻雞和裕禾1號肉雞)；慢速型黃羽肉雞配套系2個(園豐麻雞2號和港豐瑤黑麻雞)。其中，中快速型黃羽肉雞多為我國地方黃羽雞種(父系)與引進快大型隱性白羽肉雞(母系)品種雜交選育而成，根據線粒體的母系遺傳規律，配套系商品代多含有引進快大型隱性白羽肉雞的線粒體遺傳信息。而慢速型黃羽肉雞，為保持我國地方雞品種的優良品質，多不引入快大型肉雞血統。AA肉雞和羅斯308受精蛋來源于國家家禽生產性能測定站，其他雞種受精蛋來源于相關公司(表1)，每個雞種收集受精蛋300個，在同一條件下孵化出雛。

表1 雞種來源和血液采樣數

1.2 試驗方法

1.2.1 生產性能測定 所有雞種統一飼養于國家家禽生產性能測定站，按照各自公司提供的飼養規程飼養管理，生產性能測定方法參照行業標準《家禽生產性能名詞術語和度量計算方法》(NY/T 823-2020)執行。

1.2.2 血樣采集和總DNA提取 各雞種血液采樣數見表1，翅靜脈采血，ACD抗凝。參照文獻方法提取血樣基因組總DNA[35]，1.0%瓊脂糖(Promega，美國)凝膠電泳檢測提取效果。

1.2.3 引物設計和合成 參照紅色原雞線粒體D-loop區全序列(序列號: NC_007235)，利用Primer Premier 5.0設計引物，PF：5′- AAACACCCAAA- CTCACTAAC-3′；PR：5′-CACTGGGATGCGGA-TACTTGC-3′，擴增全長為1 586 bp，引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.4 PCR擴增和測序 采用50 μL擴增體系：其中DNA模板2 μL，2×PCR Master Mix(大連寶生物公司)25 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各1.5 μL，滅菌雙蒸水20 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共32個循環；最后72 ℃ 10 min。采用1.2%瓊脂糖(Promega，美國)凝膠電泳檢測PCR擴增效果，之后交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序工作，測序方法采用Sanger法，所有序列均采用雙向測序。

1.3 數據處理和分析

采用SeqMan程序拼接測序序列，剪去多余片段后通過BioEdit軟件與紅色原雞參考序列(NC_007235)逐堿基比對。利用DnaSP 5.10軟件統計突變位點總數和單倍型數等遺傳多樣性信息[36]。利用MEGA 5.05軟件構建基于雙參數遺傳距離的系統發育樹[37]。利用Network 10.2軟件構建中介網絡關系圖。利用SPSS 22.0軟件進行相關性分析。

2 結 果

2.1 不同類型肉雞群體生長性能測定

本研究測定了公母雞平均體重約1.8 kg時不同雞種的日齡和飼料轉化比(表2)。結果顯示，當群體平均體重約1.8 kg時，白羽肉雞約為5周齡，飼料轉化比為1.60∶1～1.65∶1；中快速型黃羽肉雞約為8～11周齡，飼料轉化比為2.09∶1～2.51∶1；慢速型黃羽肉雞約為14周齡，飼料轉化比為3.13∶1～3.35∶1。

表2 不同雞種初生重及公母平均體重約1.8 kg時的日齡和飼料轉化比

2.2 不同類型肉雞群體線粒體D-loop區突變位點和單倍型分布特征

6個雞種線粒體D-loop區突變位點和單倍型分析顯示(表3)，314個個體共發現37個突變位點，可劃分為40種單倍型。由Network10.2構建的中介網絡關系圖(圖1)可以看出，40種單倍型明顯地分成了A、B、C和E 4個單倍型群(分枝)，4個單倍型群分別含有9、17、5和9種單倍型以及34、65、45和170條序列。其中，出現頻率最高的為單倍型E1，存在于5個品種89個個體中；其次是單倍型E3，共出現59次；再次是單倍型C2，共出現27次；第四是單倍型B1，共出現18次。

圖1 6個雞種線粒體D-loop區40種單倍型Network圖

表3 6個雞種線粒體D-loop區突變位點和單倍型分布

進一步分析顯示(表4)，白羽肉雞和中快速型黃羽肉雞E單倍型比例較高，在AA肉雞、羅斯308、禽雁麻雞和裕禾1號肉雞中占比分別為85.92%、50.00%、100.00%和70.21%；慢速型黃羽肉雞配套系園豐麻雞2號和港豐瑤黑麻雞E單倍型占比相對較低，分別為15.00%和22.39%，園豐麻雞2號優勢單倍型為B單倍型，占比66.67%(40/60)；港豐瑤黑麻雞優勢單倍型為C單倍型，占比40.30%(27/67)。

表4 不同雞種線粒體D-Loop區全序列單倍型特征

2.3 不同雞種生長性能與線粒體D-loop區單倍型之間的相關性分析

對不同類型肉雞生長性能和線粒體單倍型比例之間進行相關性分析(表5)。初生重與E單倍型比例之間呈極顯著正相關(P<0.01)，與A、B和C單倍型比例之間均呈負相關，并與B和C單倍型比例之間負相關水平顯著(P<0.05)；公母平均體重約1.8 kg時日齡與E單倍型比例之間呈顯著負相關(P<0.05)；公母平均體重約1.8 kg時飼料轉化比與E單倍型比例之間呈極顯著負相關(P<0.01)，而與B和C單倍型比例之間呈顯著正相關(P<0.05)。

表5 雞生長性能與線粒體D-loop區單倍型之間的相關性分析

2.4 系統進化樹的構建

采用NJ法將本研究中所獲得的40種單倍型與從GenBank數據庫中下載的19條紅色原雞線粒體D-loop區全長序列構建系統發育樹(圖2)。下載的紅色原雞序列涵蓋滇南亞種(Gallusgallusspadiceus，GGS)、指名亞種(Gallusgallusgallus，GGG)、印度亞種(Gallusgallusmurghi，GGM)、海南亞種(Gallusgallusjabouillei，GGJ)和印尼亞種(Gallusgallusbankiva，GGB)的序列。

由圖2可見，A、B、C和E 4種單倍型在發育樹中均單獨形成進化枝。其中A分支9種單倍型和B分支17種單倍型均與原雞滇南亞種(GGS)聚為一枝，A分支所有個體均與GGS5(GU261695)聚為一枝，B分支所有個體與GGS8(GU261704)和GGS1(NC007235)交叉聚為一枝。E分支9種單倍型與原雞印度亞種(GGM1、GGM3和GGM4)交叉聚為一枝。5種C單倍型聚類形成C分支，并與原雞印度亞種GGM2、滇南亞種GGS10、指名亞種GGG1和GGG2以及印尼亞種GGB等4種紅色原雞亞種5條序列聚為一類。

(轉下頁 Carried forward)

圖2 基于線粒體DNA D-loop區采用鄰接法構建系統發育樹

3 討 論

3.1 不同類型肉雞群體mtDNA控制區單倍型特征

本研究對6個不同類型肉雞品種(配套系)314個個體線粒體控制區序列進行研究，共發現37個突變位點和40種單倍型，參照文獻規定的單倍型分類通用標準[38]，40種單倍型主要分為A、B、C和E共4個單倍型群。白羽肉雞和中快速型黃羽肉雞均以E單倍型為優勢單倍型，占比均≥50%；而慢速型黃羽肉雞E單倍型占比均<25%，其中園豐麻雞2號B單倍型含量較高(66.67%)，港豐瑤黑麻雞C單倍型含量相對較高(40.30%)。有研究顯示，中快速型黃羽肉雞、817雜交肉雞以及高產蛋雞E單倍型含量較高，而地方雞種和慢速型黃羽肉雞E單倍型含量則相對較低，與本研究結果一致[39]。據文獻記載，線粒體E單倍型普遍存在于印度半島、中東和歐洲地方雞品種中，為這些地區雞種的主要單倍型。但是在中國目前還未發現E單倍型占絕對優勢的地方品種，且只在少數地方雞種中被檢測到[40]。E單倍型在中快速型黃羽肉雞中的高比例存在，揭示了歐美商品雞包括隱性白羽雞和安卡紅雞等在我國肉雞配套系的成功培育中貢獻突出。

3.2 肉雞生長速度與線粒體單倍型相關性分析與應用

為了滿足消費者多元化需求，我國大批黃羽肉雞配套系被成功培育，按其生長速度可劃分為快速型、中速型和慢速型三大類。由于我國地方雞品種生長速度一般較慢，因此在培育中快速型配套系時，一般引入快大型隱性白羽肉雞血統來提高生長速度，且在雜交過程中多以快大型隱性白羽肉雞為母本，因此后代可較完整地遺傳母本的線粒體遺傳信息。本研究對不同生長速度類型肉雞群體生產性能與線粒體D-loop區單倍型進行相關性分析，結果顯示，所涉及到的肉雞群體E單倍型與初生重之間呈極顯著正相關、與公母平均體重約1.8 kg時日齡和飼料轉化比之間分別呈顯著和極顯著負相關，即E單倍型比例越高，雞群達到1.8 kg時日齡與快大型白羽肉雞越接近。在本研究中，兩個快大型白羽肉雞中E單倍型所占比例分別為50.00%和85.92%，遠遠高于只有地方雞血統的慢速型黃羽肉雞的15.00%和22.39%，可見，擁有較高線粒體E單倍型占比的快大型白羽肉雞在中快速型黃羽肉雞的育種中貢獻較大。有研究顯示，利用線粒體標記進行動物輔助選育是可行的[29-31]，近年來在植物上也有相關報道。錢明娟等[41]基于線粒體基因組DNA開展了水稻不育系品種細胞質進化和鑒定方法研究，成功研發了一套線粒體分子標記。張躍建等[42]基于甜瓜線粒體基因組富含SSR位點及父系遺傳的特性，對328個位點進行了標記開發，有助于甜瓜的育種和種質資源保護。目前，有關線粒體基因組分子標記在雞配套系選育方面應用的研究還未見相關報道，然而由于線粒體母系遺傳的獨有特性以及線粒體E單倍型在中快速型肉雞培育過程中的重要作用，線粒體標記在肉雞育種工作中應用前景廣闊。

3.3 不同類型肉雞群體系統發生關系和母系起源

家雞不僅品種豐富，而且飼養范圍廣泛，其馴化過程和母系起源自達爾文時代以來就備受廣大學者關注[43-45]。2006年，Liu等[38]基于mtDNA控制區第一高變區對世界家雞和紅色原雞的世系構成進行研究，發現主要包括A、B、C、D、E、F、G、H和I型等9個母系。2013年，Miao等[46]對世界各地家雞樣本線粒體控制區序列進行了系統研究，揭示了家雞和紅色原雞的世系構成除了Liu等[38]的研究結果外，還包括W、X、Y和Z型。本研究聚類分析結果發現，擁有A或B單倍型的個體均僅與原雞滇南亞種交叉聚為一枝。且有研究顯示，我國地方雞品種中絕大多數以A或B單倍型為優勢單倍型[24]。由此推測，在我國地方雞品種長期馴化以及慢速型黃羽肉雞選育過程中，均保留了原雞滇南亞種母系血統。本研究中，E單倍型所有個體均僅與紅色原雞印度亞種交叉聚為一枝。據文獻記載，E單倍型是南亞和歐美商品雞的主要單倍型[38]。廣大育種者在中快速型肉雞配套系的選育過程中引入了這些外來雞種血液，進而加快了育種進程。而擁有C單倍型的個體分別與原雞指名亞種、滇南亞種、印度亞種以及印尼亞種交叉聚為一枝，可見C分支在長期馴化過程中可能受到多種原雞亞種血統的影響，母系起源頗為豐富。

4 結 論

本研究中，6個肉雞群體314個個體線粒體D-loop區全序列共發現37個突變位點，共組成40種單倍型，并劃分為A、B、C和E共4個單倍型群。線粒體單倍型與肉雞生長速度相關緊密，其中E單倍型與肉雞生長速度呈現極顯著正相關。E單倍型為白羽肉雞和中快速型黃羽肉雞的優勢單倍型，而在慢速型黃羽肉雞群體中其比例普遍較低。母系起源分析顯示，原雞滇南亞種為A和B單倍型群的主要起源，印度亞種為E單倍型群的主要起源，而C單倍型群則起源于原雞指名亞種、滇南亞種、印度亞種和印尼亞種。