引導編輯系統的研究與應用進展

鄒惠影，李俊良，朱化彬

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

隨著生命體基因組序列的揭示及生物信息學的發展，對基因組上的堿基進行精確改造一直是生命科學領域重要的研究課題。第三代基因編輯技術CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated 9)系統是繼TALEN、ZFN之后的又一重大突破，它的出現開啟了基因編輯的新時代，在生物醫學、農林畜牧等方面展示出了巨大的應用前景。

CRISPR/Cas9系統由Cas9核酸酶和單向導RNA(single guide RNA，sgRNA)組成，sgRNA招募Cas9蛋白結合到靶位點，Cas9識別靶位點下游的 PAM(protospacer adjacent motif, PAM)基序，并對PAM上游3～5 nt進行切割，產生DNA雙鏈斷裂，誘發細胞啟動修復機制，發生非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)，該過程可引入片段的插入或缺失；或在供體DNA存在下發生同源介導修復(homology-directed repair, HDR)，進行精確修復[1-3]。由于CRISPR/Cas9系統的操作簡單及高效編輯，該系統已經在動物、植物和微生物中進行廣泛應用，包括遺傳育種、特定遺傳性疾病的修復、潛在藥物靶標的驗證和全基因組篩選挖掘基因生物學功能[4-6]。科研工作者將CRISPR/Cas9系統分別與胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶整合，發明了高效誘導單堿基編輯的單堿基編輯系統，包括胞嘧啶單堿基編輯器(cytosine base editor, CBE)[7]和腺嘌呤單堿基編輯器(adenine base editor, ABE)[8]。CBE能夠將C/G向T/A轉變，而ABE則可將A/T轉變成G/C。然而，單堿基編輯器會在高效編輯單堿基的同時產生嚴重的脫靶突變，并且不能實現堿基之間的顛換(A-T或C-G)[9-10]。

引導編輯 (prime editing, PE) 系統是基于CRISPR/Cas9系統新研發出的一項靶基因修飾技術，在無需供體DNA存在下可以實現任意堿基的互換、短片段的插入和缺失，是基因修飾強有力的工具，將基因編輯提升了一個新的水平[11]。PE系統將會在精準育種、糾正致病性的遺傳突變和構建動物疾病模型等方面有廣闊的應用前景。

1 引導編輯系統的概況及特點

2019年，Anzalone等[11]開發了“search and replace”全新基因編輯技術-prime editing系統，被Nature 雜志評論是“超精確的新型基因編輯工具”。PE系統包括Cas9切口酶(Cas9 nickase，nCas9)、反轉錄酶(reverse transcriptase，RT)和引導編輯向導RNA(prime editing guide RNA，pegRNA)，其中nCas9與RT融合在一起。pegRNA包括引導nCas9結合靶位點的spacer(sgRNA)、primer binding site (PBS)和目標序列(RT以此序列為模板將新的遺傳信息寫進基因組里，被稱為RT模板)。pegRNA引導nCas9-RT復合體結合到基因靶位點，nCas9在PAM序列上游3 nt產生切口，切割鏈3′端與PBS互補結合，之后RT以RT模板進行延伸合成新的堿基信息(圖1)。攜帶3′ 端編輯Flap的編輯產物與攜帶5′端非編輯Flap的產物穩定平衡，其中5′端非編輯Flap被核酸酶切除可以獲得一條編輯鏈和一條非編輯鏈的產物，在細胞修復后最終獲得穩定編輯的DNA。

圖1 引導編輯系統的構成及工作模式

PE系統不需要供體DNA，并且不需要產生雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSB)，即可實現堿基之間的自由替換及目標位點堿基精確插入與刪除(插入的堿基長度可達44 bp，刪除的堿基長度可達80 bp)[11]。與單堿基編輯系統相比，對于位于單堿基編輯器編輯窗口(4～8 nt)的CG或AT， PE系統在大部分位點的編輯效率較低，并且會引入更多的插入缺失突變。但是在精準度方面，PE系統能準確編輯目標堿基，而單堿基編輯器在編輯窗口有多個可編輯的CG或AT的情況下會產生多種編輯產物，其中只編輯目標堿基的產物占比較少。對于小片段插入和缺失的精確編輯，與CRISPR/Cas9介導的HDR相比，PE系統不需要供體DNA，產生更少的由于DBS誘發的插入缺失突變，而編輯效率與HDR相近(表1)。

表1 PE系統、BE系統和HDR的比較

2 引導編輯系統的優化

為了提高PE系統的編輯效率，Anzalone等[11]對Prime編輯器(prime editor，PE)進行了優化與改進。在PE1中，莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase,M-MLV RT)與nCas9(H840A)的C端連接，并在同一個質粒中表達。PE1介導的單堿基替換效率依賴PBS的長度，編輯效率為0.7%～5.5%；PE1介導的堿基的插入與缺失效率為4%～17%。為了提高M-MLV RT的耐熱性、持續合成能力和DNA/RNA結合能力，研究者在M-MLV RT中引入5個突變(D200N/L603W/T330P/T306K/W313F)，將單堿基突變效率提高了1.6～5.1倍，這個改造后的系統被稱為PE2[11]。研究表明，在非編輯鏈引入一個切口可以促使以編輯鏈為模板進行DNA修復，從而提高編輯效率，因此，在PE2的基礎上，引入一個經典sgRNA與靶位點結合，引導nCas9在非編輯鏈產生切口，突變效率提高了3倍，這個系統被稱為PE3[11]。研究顯示，非編輯鏈切口距離編輯鏈切口約50 bp時的編輯效率較高。如果設計的sgRNA只能與編輯后序列匹配，與原序列不匹配，那么nCas9會在編輯鏈Flap拆分之后才在非編輯鏈產生切口，這樣可以減少產生非必要的脫靶突變，這種設計策略被稱為PE3b[11]。

為了進一步提高PE系統的編輯效率，Chen等[12]進行了CRISPR干擾(CRISPR interference, CRISPRi)篩選，發現DNA錯配修復(DNA mismatch repair, MMR)相關基因抑制了PE的效率，并促進產生indel副產物。為解決這一問題，他們嘗試與PE系統共表達MMR通路相關基因顯性負性突變體(dominant negative MLH1, MLH1 dn)，結果顯示MLH1 dn能有效增強PE的基因編輯效率。PE2與MLH1 dn的組合被稱為PE4，PE3與MLH1 dn的組合稱為PE5。與相應的PE2和PE3相比，PE4和PE5的編輯效率分別提高了7.7倍和2倍，并且目標編輯產物的純度提高了3.4倍[12]。之后，Da Silva等[13]也得出MMR能夠抑制PE系統的結論；通過消除MMR，PE系統的效率提高了2～17倍。

除此之外，科研工作者還在擴展PE系統的編輯范圍(刪除和插入)、nCas9-MMLV融合蛋白的結構、pegRNA的設計、PE系統的遞送、抗藥性篩選和報告系統富集編輯細胞等方面對PE系統進行優化。

Jiang等[14]和Choi等[15]在PE系統基礎上分別研發了PE-Cas9-based deletion and repair (PEDAR)和PRIME-Del工具。這兩種工具都是用Cas9蛋白替換PE系統中的nCas9，并且在插入/刪除位置的上、下游設計一對pegRNA，借助細胞修復過程中微同源介導的末端連接(microhomology-mediated end joining，MMEJ)或單鏈退火(single strand annealing，SSA)途徑完成修復。PEDAR被驗證可以精確進行60 bp的插入和大于10 kb片段的刪除；PRIME-Del被驗證可以精確進行大于10 kb片段的刪除，在基因治療領域和基礎生物學蛋白質功能研究等方法中有潛在的應用。隨后，Anzalone等[16]開發了twin prime editing (twinPE)工具，包括原始PE系統的PE蛋白和兩個pegRNA。twinPE能夠高效進行108 bp的插入和818 bp的刪除。另外，twinPE結合Bxb1 整合酶可以在基因組特定位點整合5.6 kb的片段和糾正長達40 kb的基因倒置。twinPE工具的pegRNA在基因組的不同靶位點產生單鏈缺口，相比較PEDAR 和PRIME-Del會產生更少的副產物。最近，Wang等[17]開發了GRANDE diting系統，利用一對特殊設計的pegRNA實現長達1 kb DNA片段的靶向插入。

Liu等[18]在SpCas9與M-MLV序列的N端和C端添加了c-Myc NLS和SV40 NLS，構成了PE2*；用SaCas9和SaCas9KKH變體替換SpCas9，構成了SaPE2*和SaKKHPE2*。經檢測，在小鼠轉基因和內源基因的堿基替換、插入、缺失編輯過程中，PE2*的效率都要高于PE2的編輯效率；SaPE2*在一些位點編輯效率與PE2*相差不多，但是SaKKHPE2*的編輯效率一直較低。Xu等[19]構建了PE-P2，利用自切割多肽2A串聯表達PE系統和篩選標記，并采用強化的sgRNA，使水稻基因組中靶位點突變效率提高了22倍(從1.2%到26%)。該團隊還發現，在RT模板中引入同義錯配堿基和nCas9的C端融合M-MLV均可提高PE系統的編輯效率。將這兩種策略組合使用時，出現了倍增協同效應，PE系統在水稻中的平均編輯效率達到了24.3%，在玉米原生質中達到了6.2%,在人細胞中達到了12.5%[20]。Lu等[21]通過密碼子優化和CaM35S啟動子優化提高了PE系統的編輯效率。研究者還同時對nCas9-MMLV融合蛋白多個方面進行優化，構建出具有更強編輯效果的PEmax。這些優化包括MMLV的優化密碼子、Cas9n突變體、Cas9n與MMLV添加連接序列和增加NLS序列[12]。

pegRNA的3′端延伸在PE系統工作時暴露在細胞中(未被融合蛋白包裹)，容易被核酸酶降解。為解決這一問題，多個課題組通過對pegRNA的3′端添加RNA結構基序來增加pegRNA的穩定性，進一步提高了PE系統的編輯效率。這些結構基序包括G-quadruplex[22]、xrRNA[23]和tevopreQ1(trimmed evopreQ1)[24]等。添加tevopreQ1的epegRNA與MLH1 dn和 PEmax協同作用可顯著提高編輯效率，其中PE4 max和epegRNAs在Hela細胞和HEK293T細胞中的編輯效率分別提高了72倍和3.5倍；PE5 max和epegRNAs在Hela細胞和HEK293T細胞中的編輯效率分別提高了12倍和1.6倍[12]。Li等[25]通過規律性引入同義突變和pegRNA骨架優化，開發了新型引導編輯系統sPE和aPE，提高了編輯效率。與PE3相比，sPE3的編輯效率平均提高353倍；aPE3的編輯效率平均提高2.77倍。另外，對pegRNA的優化還包括PBS和RT模板兩方面。PBS和RT模板的長度與編輯效率沒有絕對的對應關系，通常需要設計不同長度的PBS進行編輯嘗試。研究工作者建議PBS的起始長度為13 nt，但是當編輯位點的G/C含量超出40%～60%時，可適當延長或縮短PBS長度。RT模板的建議起始長度為10～16 nt，并且RT模板與sgRNA骨架3′端連接的第一個堿基不能是C，否則編輯效率會降低。Lin等[26]從PBS與切割鏈結合的緊密程度入手研究，發現PE系統在PBS的Tm值為30 ℃時編輯效率最高，Tm值過低或過高都會影響編輯效率。他們還用雙pegRNA策略對靶位點的雙鏈分別產生切口和寫入編輯序列，將編輯效率提高了1.8～4.2倍，并且沒有產生額外的插入/缺失突變。采用優化的PBS結合雙pegRNA策略，PPE系統在水稻中的效率提高了2.9～17.4倍。

科研工作者還嘗試用piggyBac載體[27-28]、腺病毒載體[29]遞送PE系統或者將PE系統構成一元載體[30]、將PE系統分離成多個載體[31]進行基因編輯。這些改進都能使PE系統發揮作用，拓展了PE系統的應用范圍。Xu等[32]在PE系統中加入HPT抗性基因構建了pPE2、pPE3/3b，在水稻中對1個外源和3個內源基因進行小片段編輯，最高編輯效率達到31.3%，并將HPT-ATG回復突變加入到篩選過程中構建了surrogate PE2系統，該系統能夠富集編輯細胞，不同程度提高編輯效率。另外，科研工作者還利用巧妙設計的報告系統富集編輯的細胞提高PE系統的編輯效率[33-34]。

3 引導編輯系統的應用

由于PE系統強大的編輯功能及普適性，其一經報道，便迅速在各種物種及各個研究領域進行了應用。下面詳細講述PE系統近期在動物和植物中的推廣與應用(表2)。

表2 PE系統的應用

3.1 引導編輯系統在動物中的應用

目前PE系統在人和小鼠中的應用較多。Anzalone等[11]利用優化后PE3在HEK293T細胞中進行了24種單堿基編輯，其中包括12種堿基的轉換和顛換，平均編輯效率為(33±7.9)%。進而，科研工作者又利用PE3進行了小片段的插入和缺失編輯，1 bp和3 bp的插入效率分別為(32±9.8)%和(39±16)%；1 bp和3 bp的刪除效率分別為(29±14)%和(32±11)%。PE3還被用于模擬鐮刀型細胞貧血(AT-TA)、黑蒙性白癡(TATC插入)和朊病毒病(GC-TA)病因突變，并高效回復突變。并且，研究者還在K562、U2OS和Hela細胞及終端分化細胞原代小鼠皮層神經元中應用了PE3系統，發現均能成功編輯[11]。Sürün等[35]利用PE系統分別在HEK293T和hiPS細胞中進行GFP到CFP的編輯，編輯效率分別為0.3%～6.5%和7.5%左右，比BE系統在HEK293T(13%～47%)和hiPS細胞(80%)中的編輯效率低很多。Schene等[36]利用PE系統在人小腸和肝類器官中實現模擬與癌細胞相關CTNNB1基因6個堿基的刪除，精確編輯效率為30%～50%，與2-D細胞水平的編輯效率相似。另外，該課題組還分別對DGAT1突變(第7外顯子3個堿基缺失c.629_631 delCCT)病人來源的小腸類器官和患威爾遜病(ATP7B一個堿基的重復c.1288 dup)病人來源的肝類器官進行精確基因回復。與HDR相比，PE系統會產生更少的非必要插入缺失突變。Geurts等[37]在成體干細胞來源的結腸類器官和肝類器官中模擬了TP53的多種突變類型，其中在結腸類器官中的編輯效率最高為25%，在肝類器官中的最高達到97%。該課題組還比較了PE系統、ABE系統和CRISPR/Cas9介導的HDR三種編輯系統對CFTR-R785*突變的回復效率，結果顯示PE系統編輯效率為0～5.7%，ABE為9.1%，CRISPR/Cas9介導的HDR為1.22%。PE系統的編輯效率介于堿基編輯器和CRISPR/Cas9介導的HDR之間，但是對于不在BE系統editing window的突變，PE系統是相對較好的選擇。

Liu等[38]首次利用PE系統構建了人類并指畸形的小鼠模型。人類并指畸形致病變異是基因HOXD13兩個堿基的顛換(G-C/G-T)?？蒲泄ぷ髡咴谂咛?-cell期顯微注射PE系統mRNA，在囊胚期兩種突變獲得效率分別為8/18(44%)和12/16(75%)；注射胚胎移植到代孕母親體內獲得突變小鼠的效率分別為8/30(27%)和2/19(11%)。突變胚胎和小鼠的高通量測序結果顯示顯微注射會導致突變嵌合。Gao等[39]分別利用PE系統和CRISPR/Cas9介導的HDR制備CArG box突變小鼠，該位點位于Tspan2啟動子內，是轉錄因子結合位點，獲得的小鼠在主動脈和膀胱檢測不到Tspan2 mRNA的表達。PE系統和HDR獲得正確編輯小鼠的效率分別為26%和54%。研究者發現，11只HDR小鼠在靶位點都有不同程度的插入突變(0.91%～93.91%)，在10只PE鼠中沒有檢測到；在5只HDR鼠中檢測到不同程度的脫靶突變(5.5%～60.2%)，同樣在PE鼠中沒有檢測到高于對照鼠的突變。Liu等[18]通過尾靜脈注射方法在小鼠肝中對癌基因Ctnnb1進行突變，注射PE2*的小鼠肝產生更多的腫瘤。另外，他們還用Split-Intein內含肽介導分拆PE，并用AAV載體進行遞送，成功對小鼠肝SERPINA1致病突變進行精確回復。

PE系統還被應用于其他模式動物。Petri等[40]利用PE系統對斑馬魚的基因組進行精確編輯，其中5 bp和10 bp刪除效率為4.13%～33.61%，小片段的精確插入效率高達18%。另外，作者還成功在斑馬魚中制備了兩個基因的致病變體TYR P301L和KRAS G12V，并通過生殖系傳遞給后代。Bosch等[41]在果蠅中也成功應用了PE系統，經檢測在S2R+細胞中，PE系統編輯效率約為4%～8%；通過轉基因雜交和胚胎注射也能有效編輯果蠅生殖細胞，其中轉基因雜交獲得生殖系傳遞正確編輯效率最高為36%，胚胎注射為5.3%。研究表明，在大部分動物基因組編輯過程中，PE3的編輯效率要高于PE2。

3.2 引導編輯系統在植物中的應用

Lin等[42]通過對PE系統進行密碼子優化首次建立了適用于植物的引導編輯系統(plant prime editing，PPE)。PPE系統在水稻和小麥基因組中實現了12種單堿基替換(0.2%～8.0%)、多堿基替換(0.6%～1.5%)及小片段插入(1.1%)和缺失(4.3%)。研究結果顯示，編輯效率受RT模板長度影響較大，在37 ℃條件下反應效果最好，在非編輯鏈產生切口的策略對PPE系統效率影響不大。最后作者還構建了二元載體，編輯效率高達21.8%。隨后，Tang等[43]對水稻的10個基因進行靶向編輯，最高編輯效率達到1.55%。研究結果也表明，在非編輯鏈產生切口并不能提高PE系統在水稻中的編輯效率。Li等[44]成功在水稻中對外源hptII突變基因和內源OsEPSPS基因實現了精確編輯，其中外源基因的編輯效率為9.38%，內源基因的編輯效率為2.22%。Butt等[45]利用PE系統對水稻的除草劑抗性基因OsALS、提高產量基因OsIPA和調控側枝基因OsTB1進行了精確編輯。Hua等[46]利用Sp-PE2和Sp-PE3分別對水稻中轉基因的突變GFP和內源基因ALS、APO1等進行堿基替換、缺失和插入。突變GFP的回復編輯效率分別為15.6%和17.1%，內源基因只有ALS的堿基替換效率為9.1%，其他內源基因均檢測不到突變效率，可見PE系統對不同靶位點的作用情況不同。

科研工作者在其他植物中也陸續開展了PE系統的研究。Jiang等[47]通過增加PE中pegRNA表達框的數量及優化pegRNA驅動啟動子提高pegRNA的表達量，首次對玉米兩個乙酰乳酸合酶基因ZmALS1和ZmALS2進行堿基替換(W542L和S621I)，編輯效率高達4.8%～53.2%，并且獲得ZmALS1和ZmALS2純合突變體。該研究的編輯效率較之前水稻中的研究有了很大的提升，為進一步優化植物PE系統提供了方向。Lu等[21]首次對雙子葉植物番茄GAI、ALS2和PDS1三個基因進行了堿基替換、插入突變?？蒲泄ぷ髡哌€嘗試對馬鈴薯基因組進行編輯，但是編輯效率非常低[48]。另外，PE系統也成功對擬南芥[49]、煙草[49]和小立碗蘚[48]等其他模式植物的基因組進行了精確編輯。

4 引導編輯系統設計工具

隨著PE系統的廣泛應用，很多課題組研發了pegRNA的設計工具方便科研工作者應用PE系統。Schene等[34]基于PBS序列設計和雙pegRNA策略，開發了植物pegRNA設計網站PlantPegDesigner(http://www.plantgenomeediting.net/)，為使用者提供了pegRNA選擇與推薦方案。Bhagwat等[50]開發了multicrispr工具，該工具可以針對包括PE系統等多種基于CRISPR的編輯方法進行gRNA設計。Hsu等[51]針對prime editing系統合作開發了一項友好的網頁設計工具—PrimeDesign(http://primedesign.pinellolab.org/)，并利用此工具構建了一個全面和可搜索的數據庫—PrimeVar，該數據庫包含了對超過68 500種人類致病性遺傳變異的模擬和糾正的pegRNA和ngRNA組合。Chow等[52]開發了pegFinder(http://pegfinder.sidichenlab.org/)，為PE2和PE3設計pegRNA，并且報告中還給出不同長度的RT模板和PBS序列供實驗人員選擇。Morris等[53]對人類致病性疾病遺傳變異設計了模擬和糾正的PE系統，并通過Cas9替代酶和延長RT模板策略，使覆蓋的致病變異達到了50 000以上，收集在以下網站(https://primeedit.nygenome.org/)。Hwang等[54]向PE系統應用者提供了兩個免費的網站PE-Designer(http://www.rgenome.net/pedesigner/)和PE-Analyzer(http://www.rgenome.net/pe-analyzer/)。PE-Designer可以進行pegRNA的設計，包括目標序列潛在的靶位點、pegRNA延伸序列及切口sgRNA的序列；PE-Analyzer專門用于PE結果分析，接受高通量測序數據，能夠輸出突變分析的表格及作圖。

5 引導編輯系統的脫靶效應

脫靶效應一直是基因編輯工具比較關注的重點，為了檢測PE系統的脫靶風險，Jin等[55]率先在農作物中深入評估了PPE系統的脫靶效應。研究人員發現，PPE系統對間隔序列近PAM端及PBS的5′端的錯配容忍度較低。通過對pegRNA的179個內源潛在脫靶位點的編輯情況進行高通量檢測，結果顯示PPE系統在水稻中的脫靶編輯效率很低(0～0.23%)，其中有8個位點攜帶一個或兩個錯配堿基，脫靶編輯效率僅為0～0.02%。研究人員還對依賴pegRNA和不依賴 pegRNA的全基因組范圍內可能產生的堿基替換 (single nucleotide variants, SNVs) 和小片段的插入與缺失(insertions/deletions, Indels)進行統計，發現PPE系統幾乎不會在基因組內引發額外的SNVs或Indels突變。另外，在植物體中過表達PPE系統不會干擾細胞內源的逆轉錄生物學過程，也不會在全基因組范圍內產生pegRNA或mRNA序列的隨機插入[55]。以上結果表明PPE在植物中有很高的編輯特異性。

Kim等[56]利用nDigenome-seq在人的細胞中評估了PE系統的特異性，主要評估PE系統的主要組成nCas9的特異性，在9個靶位點中只檢測到5個脫靶位點，脫靶編輯效率為0.1%～0.9%，說明PE系統的特異性較高，并且通過應用改造的Cas9變體會進一步提高PE系統在人細胞中的編輯特異性。

6 引導編輯系統的發展前景

目前PE系統已在多個物種中進行成功編輯，有廣泛的普適性。PE系統不產生DSB，通過引入編輯模板即可精確進行小片段的插入/缺失及堿基間的任意替換，靶位點序列要求不嚴格，廣泛存在于基因組中。與BE系統相比，PE系統編輯效率雖然偏低，但是對于在BE系統編輯窗口(4～8 nt)存在多個可編輯堿基、編輯窗口之外及不可編輯類型(堿基顛換)的突變，PE系統是更好的選擇。與CRISPR/Cas9介導的HDR相比，PE系統編輯效率相當或優于HDR，但是可大大減少由于HDR引入的插入突變，因此從整體水平上，PE系統是優于HDR的。另外，多個物種的應用顯示，PE系統的特異性高，脫靶效應低，對于動植物精準育種和微突變引起的疾病治療等方面有很大的應用潛力。

PE系統效率影響因素較多，不同物種的應用效率不同，不同靶位點效率不同，另外，PBS和RT模板的長度和反應溫度也會影響PE系統的效率。因此，為了推進PE系統的廣泛應用，開發出針對不同物種的pegRNA設計及效率預測網站很有必要。目前，科研工作者在改造Cas9、擴展PE系統編輯范圍、提高pegRNA穩定性、載體遞送和篩選系統等方面對PE系統進行優化，都取得了很好的進展。下一步，研究者可以考慮開展不同優化方向協同作用的研究，更進一步提高PE系統的編輯效率。PE系統在不同物種中的編輯效率差異較大，在動物中的平均編輯效率比植物高，在馬鈴薯中尤其低。尋找不同物種中限制PE系統編輯效率的因素，進一步優化PE系統以適應該物種的應用，也是未來重要的研究方向。

自PE系統成功開發以來，科研工作者就從多個方面對其進行優化，已經取得了很大的進展，未來仍然可期?？傊?，PE系統在動植物基因功能研究和育種方面有非常廣闊的前景，并且該技術有可能成為一種新的基因治療形式，以安全、高靶向的方式插入治療基因，以替代突變或缺失的基因。