PLAU和AKT1在口腔鱗癌中的表達

孫二燦，肖巧玲，夏飛飛，劉 喆，徐 江，黎昌學

口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是以組織浸潤和淋巴結轉移傾向為特征的惡性腫瘤，其發病率在所有癌癥中排名第六，全球每年新增OSCC病例超過20萬例[1]。手術聯合化療可以提高OSCC患者的總生存期，術前化療可縮小腫瘤，術后化療可預防腫瘤復發轉移。因此，進一步研究OSCC的發病機制，尋找OSCC預后和靶向治療的有效分子標志物，具有重要的臨床意義。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路調節許多不同的細胞過程。該通路的異常激活常見于肺癌、結腸癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌[2]。尿激酶纖溶酶原激活劑(urokinase plasminogen activator，PLAU)編碼一種絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶與其受體結合后促進蛋白質水解，促進腫瘤細胞間質的降解[3]。因此，PLAU在腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移中發揮關鍵作用。然而，關于PLAU和蛋白激酶B1(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1，AKT1)在OSCC中的關系的報道較少。該研究通過檢測AKT1和PLAU在OSCC及正常組織中的表達，探討其與OSCC臨床病理及預后特征的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2008—2012年在石河子大學醫學院第一附屬醫院治療的106例OSCC和73例正常組織(對照組)。課題組選取術前未接受任何治療和不存在其他癌癥的患者，最終獲取臨床病理資料和隨訪信息完整的70例OSCC組織(OSCC組)和50例正常組織制成組織(對照組)芯片，隨訪截止日期為2020年7月30日。本研究經石河子大學第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 免疫組織化學染色采用EnVision兩步法，將組織芯片切成4 μm吸附在載玻片上去脂水合，在EDTA緩沖液中熱誘導提取抗原，在3%過氧化氫中阻斷內源性過氧化物酶活性，用3%的牛血清阻斷非特異性抗原的染色，孵育一抗PLAU(1 ∶50，貨號ab133563)和AKT1(1 ∶100，貨號ab81283)(英國Abcam公司)在4 ℃下培養過夜，DAB顯色液顯色1 min后蘇木精復染封片。免疫組織化學染色結果由2名病理醫師采用雙盲方法進行評價，免疫反應總分(immunoreactive score，IRS)計算為陽性細胞百分比乘以細胞著色強度(表1)。根據IRS值，結果分為兩組，其中≤6分為低表達組，>6分為高表達組。

表1 免疫組織化學評分表

1.3 統計學處理采用SPSS 23.0軟件對數據進行分析，采用χ2檢驗分析PLAU和AKT1的表達水平與患者臨床病理特征的相關性，使用Kaplan-Meier法進行生存分析，采用Spearman秩和檢驗分

總分=陽性細胞所占百分比分值×著色強度分值

別確定PLAU和AKT1在OSCC和正常組織表達的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

1.4 生物信息學數據庫驗證為了提高實驗的可信度，使用生物信息學數據庫進行驗證。GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)是一個在線分析網站，其包含數據來自TCGA和GTEx數據庫的9 736個腫瘤樣本和8 587個正常樣本的數據[4]。課題組首先使用GEPIA來研究OSCC和正常組織中PLAU和AKT1的表達差異，隨后課題組評估PLAU和AKT1在OSCC中高低表達與患者預后之間的聯系。最后使用GEPIA數據庫分別驗證PLAU和AKT1的表達在OSCC和正常組織的相關性。

2 結果

2.1 PLAU和AKT1在OSCC中表達情況及與臨床病理特征的關系PLAU主要分布在OSCC細胞胞質或(和)細胞膜上，AKT1主要分布在OSCC細胞細胞核或(和)細胞胞質，均呈棕黃色或黃褐色(圖1)。PLAU和AKT1在OSCC組織陽性表達率高于正常組織，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)，見表2，PLAU和AKT1表達與OSCC患者年齡、性別、TNM分期、T分期、淋巴結轉移、分化程度、吸煙史、飲酒史等均無關(P>0.05)，見表3。

表2 OSCC及正常組織中PLAU和AKT1的表達(n)

表3 OSCC中PLAU和AKT1表達與臨床病理特征的關系(n)

圖1 PLAU和AKT1在OSCC和正常組織中表達情況A1、A2：PLAU在OSCC組織中表達；A3、A4：PLAU在正常組織中表達；B1、B2:AKT1在OSCC組織中表達；B3、B4：AKT1在正常組織中表達；A1、A3、B1、B3：×100；A2、A4、B2、B4：×400

2.2 OSCC中PLAU和AKT1表達與患者的預后關系采用Kaplan-Meier分析PLAU和AKT1表達是否可以作為預測OSCC預后的指標，并繪制生存曲線檢測了70例有完整隨訪資料的OSCC患者的PLAU和AKT1表達水平與預后的關系。分析結果顯示PLAU和AKT1高表達組患者術后生存時間短于低表達組患者，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 PLAU和AKT1表達與OSCC患者預后的生存分析

2.3 OSCC中PLAU和AKT1表達的關系相關性分析顯示，在OSCC組織樣本中PLAU和AKT1呈明顯相關性(r=0.357，P=0.002)，見表4。在正常組織樣本中PLAU和AKT1無明顯相關性(r=0.24，P=0.094)，其中r為相關系數，見表5。

表4 OSCC織中PLAU與AKT1表達的關系

表5 正常組織中PLAU與AKT1表達的關系

2.4 PLAU和AKT1在生物信息學數據庫中驗證結果生物信息學數據庫驗證結果顯示PLAU和AKT1在OSCC中表達高于正常組織(P<0.05)，見圖3A、B。同樣，在OSCC中，PLAU和AKT1高表達的生存時間短于PLAU和AKT1低表達患者生存時間(P<0.05)，見圖3C、D。最后，PLAU和AKT1相關性分析顯示，在OSCC中，PLAU和AKT1表達有明顯相關性(r=0.35，P<0.001)，在正常組織中，PLAU和AKT1表達之間沒有相關性(r=0.26，P=0.088)，見圖3E、F。

圖3 GEPIA數據庫對實驗結果驗證A、B：OSCC和正常組織中PLAU和AKT1的表達差異；T：OSCC組織；N：正常組織；與正常組織比較：*P<0.05；C、D：PLAU和AKT1的表達與OSCC患者預后的生存分析；E、F：OSCC和正常組織中PLAU和AKT1表達的關系

3 討論

OSCC是一種常見的發生于口腔部位的惡性腫瘤，約90%的口腔惡性腫瘤都是OSCC[5]。PI3K/AKT信號通路在細胞增殖、生長和凋亡等具有不同的作用，特別是在促進細胞存活和抑制細胞凋亡方面發揮著重要作用[6]。AKT蛋白家族是PI3K/AKT信號通路的關鍵蛋白，其包括AKT1、AKT2和AKT3三個亞型[7]，雖然各亞型在結構上有顯著的相似性，但其功能卻存在很大差異[8]。研究[9]顯示AKT1在細胞存活、增殖、腫瘤發育、血管生成和腫瘤轉移中發揮重要作用。PLAU是一種能將纖溶酶原轉化為纖溶酶的絲氨酸蛋白酶，其在喉癌、胃癌和肝癌表達升高，同時PLAU的表達升高與其不良預后有關[10-11]。此外，PLAU可促進纖維蛋白溶解和細胞外基質降解，從而導致癌細胞擴散和轉移與PLAU表達密切相關。然而，PLAU和AKT1在OSCC中的功能和機制依然需要進一步探討。

本研究結果顯示，PLAU和AKT1在OSCC中表達高于正常組織,表明PLAU和AKT1高表達在OSCC的發生發展起重要作用。隨后課題組對PLAU和AKT1在OSCC中的表達與腫瘤分化、TNM分期、淋巴結轉移、性別、年齡、腫瘤大小、飲酒史和吸煙史等臨床資料進行相關性分析，結果顯示與上述臨床資料無明顯相關性，這可能與課題組收集樣本過少和隨訪時間較短有關，需要繼續收集病例和不斷隨訪。另外，PLAU和AKT1單獨不能影響OSCC的發展和分化，需和其他分子一起作用，這可以做進一步研究探索。Kaplan-Meier法對患者生存分析顯示PLAU和AKT1高表達組的術后生存時間明顯短于低表達組，證明了PLAU和AKT1可以用來判斷OSCC患者預后。

課題組還研究了OSCC中PLAU和AKT1之間的關系。PI3K/AKT信號通路參與腫瘤生長和血管生成，并能反映腫瘤的惡性程度[12]。此外，有研究[13]表明PLAU可通過調節PI3K/AKT信號通路促進血管內皮細胞生成。這些表明PI3K/AKT通路與PLAU存在相關性。與報道一致，課題組發現在OSCC中PLAU和AKT1之間存在顯著關聯。這些結果提示PLAU和AKT1共同促進了OSCC的發生，PLAU和PI3K/AKT信號通路在OSCC中存在著某種聯系。

為了提高本研究的可信度，使用生物信息學數據庫對PLAU和AKT1在OSCC和正常組織的差異性表達進行驗證，在OSCC中，PLAU和AKT1表達明顯升高，且高表達PLAU和AKT1患者生存時間明顯縮短，PLAU和AKT1在OSCC和正常組織中相關性分析進行驗證，生物信息學數據庫驗證結果與實驗結果一致，提示著PLAU和AKT1在OSCC中具有潛在的研究價值。