布南色林通過(guò)激活PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路對(duì)精神分裂癥大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響

徐曉津，房茂勝，繆 楹，黎維勇

精神分裂癥是一種嚴(yán)重慢性精神疾患，主要表現(xiàn)為感知覺(jué)、情感和行為異常，與大腦結(jié)構(gòu)異常、遺傳因素、妊娠分娩及環(huán)境影響等有關(guān)[1]。近年來(lái)，非典型抗精神病藥物已逐漸成為首選藥物用于各類(lèi)精神疾病治療，但研究[2-3]表明，利培酮、奧氮平等藥物對(duì)患者糖脂代謝、體質(zhì)量及激素水平存在不利影響。布南色林是一種新型治療精神分裂癥藥物，多項(xiàng)臨床研究[4-5]結(jié)果表明，布南色林對(duì)精神分裂癥的陽(yáng)性癥狀和陰性癥狀均有較好療效，且較少出現(xiàn)體質(zhì)量增加、代謝異常等不良反應(yīng)。PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，在精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展中有重要的調(diào)控作用。該研究將探究布南色林對(duì)MK-801誘導(dǎo)精神分裂癥大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響及其中PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠48只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料布南色林片購(gòu)自日本住友制藥株式會(huì)社(國(guó)藥準(zhǔn)字：J20170045)；利培酮片購(gòu)自西安楊森制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字：H20010309)；地卓西平馬來(lái)酸鹽(dizeuxipine maleate，MK-801)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Swamp公司；內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylationPI3K，p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、p-AKT、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)及p-GSK3β蛋白一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。動(dòng)物行為自動(dòng)跟蹤分析系統(tǒng)(型號(hào)：Ethovision 3.0)購(gòu)于荷蘭Noldus公司；動(dòng)物行為記錄分析系統(tǒng)(型號(hào)：Smart-16)購(gòu)于西班牙Panlab公司；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(型號(hào)：XR-XM101)購(gòu)于北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)：XL-600)購(gòu)于德國(guó)Erba公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)：CFX Connect)購(gòu)于美國(guó)BioRad公司。

1.3 方法

1.3.1動(dòng)物分組、建模與處理 將48只SD大鼠隨機(jī)分為4組：① 正常組，正常飼養(yǎng)；② 模型組，一次性腹腔注射0.6 mg/kg MK-801誘導(dǎo)精神分裂癥模型；③ 布南色林組，一次性腹腔注射0.6 mg/kg MK-801誘導(dǎo)精神分裂癥模型，灌胃1 mg/kg布南色林，連續(xù)灌胃2周，每日2次；④ 利培酮組，一次性腹腔注射0.6 mg/kg MK-801誘導(dǎo)精神分裂癥模型，灌胃0.54 mg/kg利培酮，每組12只。MK-801誘導(dǎo)造模后連續(xù)2周監(jiān)測(cè)大鼠行為學(xué)變化，選取穩(wěn)定模型大鼠進(jìn)行給藥處理[6]。根據(jù)大鼠與人之間用藥劑量換算公式：大鼠劑量(mg/kg)=6.3×人劑量(mg/kg)，70 kg成人每日利培酮?jiǎng)┝? mg、布南色林劑量12 mg計(jì)算[7]，利培酮組灌胃0.54 mg/kg利培酮，布南色林組灌胃1 mg/kg布南色林。

1.3.2行為學(xué)觀察 給藥結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)觀察。

1.3.2.1刻板行為 參照Sams Dodd刻板行為標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)各組大鼠進(jìn)行評(píng)分，分值范圍0～5分；其中幾乎靜止不動(dòng)評(píng)為0分，正常生理活動(dòng)、偶爾向前運(yùn)動(dòng)評(píng)為1分，活動(dòng)并伴有反復(fù)向前聞嗅探索為2分，連續(xù)向前聞嗅探索為3分，重復(fù)地?fù)u頭、抬頭或旋轉(zhuǎn)為4分，快速地?fù)u頭、轉(zhuǎn)圈或頭的背腹運(yùn)動(dòng)為5分。上述評(píng)分過(guò)程采用雙盲法，取均值為最終結(jié)果。

1.3.2.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 用一個(gè)開(kāi)口的黑色木箱，長(zhǎng)寬高分別為81、81、28 cm，連接動(dòng)物行為自動(dòng)跟蹤分析系統(tǒng)和動(dòng)物行為記錄分析系統(tǒng)，將大鼠輕放入木箱，讓大鼠自由探索3 min，記錄大鼠活動(dòng)總路程。

1.3.2.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮實(shí)驗(yàn)由定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)組成，前5 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，將大鼠從水迷宮的不同象限位置(遠(yuǎn)離隱藏平臺(tái)位置)、面朝黑色壁池放入水中，記錄大鼠爬上隱藏平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，取每日逃避潛伏期均值為最終結(jié)果；第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去水池中的隱藏平臺(tái)，以相同方法將大鼠放入水中，記錄大鼠1 min內(nèi)穿越平臺(tái)原位置的次數(shù)。

1.3.3樣本采集 行為學(xué)觀察結(jié)束后，禁食進(jìn)水12 h后，尾靜脈取血2 ml，靜置20 min，離心分離血清，置于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)錅y(cè)。麻醉、處死大鼠，分離海馬組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，制備組織病理切片(厚度為5 μm)，剩余組織置于液氮罐保存?zhèn)錅y(cè)。

1.3.4糖脂代謝指標(biāo)的檢測(cè) 經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、糖化血紅蛋白(hemoglobin Alc，HbA1c)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)及低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平。

1.3.5海馬組織病理?yè)p傷觀察 取海馬組織石蠟切片，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察大鼠海馬組織病理?yè)p傷情況，并根據(jù)文獻(xiàn)[9]方法評(píng)分。

1.3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)海馬組織PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá) 取海馬組織約100 mg，參照RNA提取試劑盒提取總RNA，取等量合格樣品使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA鏈，再使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，上實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共42個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算目的基因的表達(dá)。

1.3.7蛋白免疫印跡法檢測(cè)海馬組織PI3K/AKT/GSK3β通路蛋白表達(dá) 取海馬組織約100 mg加入RIPA組織細(xì)胞快速裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，各組取等量蛋白進(jìn)行電泳(分離膠濃度為10%)，經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，再取出PVDF膜置于含有5%脫脂牛奶中封閉2 h，分別加入對(duì)應(yīng)蛋白一抗，4 ℃下孵育過(guò)夜，第2天洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠二抗，37 ℃下孵育1 h，再次洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影。應(yīng)用Image J軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值，以p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β表示PI3K、AKT、GSK3β磷酸化水平。

2 結(jié)果

2.1 布南色林對(duì)精神分裂癥大鼠行為學(xué)的影響與正常組比較，模型組刻板行為評(píng)分、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總路程及逃避潛伏期升高，穿越平臺(tái)原位置次數(shù)降低(P<0.05)；與模型組比較，布南色林組和利培酮組刻板行為評(píng)分、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總路程及逃避潛伏期降低，穿越平臺(tái)原位置次數(shù)升高(P<0.05)；但布南色林組與利培酮組行為學(xué)觀察數(shù)據(jù)的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 布南色林對(duì)精神分裂癥大鼠行為學(xué)的影響

2.2 布南色林對(duì)精神分裂癥大鼠糖脂代謝指標(biāo)水平的影響與正常組比較，模型組和布南色林組FPG、HbA1c、TG、TC、HDL及LDL水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但利培酮組FPG、HbA1c、TG及TC水平升高(P<0.05)，HDL和LDL水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 布南色林對(duì)精神分裂癥大鼠糖脂代謝指標(biāo)水平的影響

2.3 布南色林對(duì)精神分裂癥大鼠海馬組織病理?yè)p傷的影響各組大鼠海馬組織切片HE染色見(jiàn)圖1。正常組大鼠海馬組織細(xì)胞排列緊密整齊，結(jié)構(gòu)層次清晰，胞體呈橢圓形或圓形；模型組海馬組織細(xì)胞排列稀疏，無(wú)明顯的結(jié)構(gòu)層次，胞核固縮嚴(yán)重；布南色林組和利培酮組仍存在胞核固縮現(xiàn)象，但細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)層次有改善。與正常組比較，模型組大鼠海馬組織病理?yè)p傷評(píng)分升高(P<0.05)；與模型組比較，布南色林組和利培酮組大鼠海馬組織病理?yè)p傷評(píng)分降低(P<0.05)，但布南色林組與利培酮組海馬組織病理?yè)p傷評(píng)分的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 布南色林對(duì)精神分裂癥大鼠海馬組織病理?yè)p傷評(píng)分的影響

圖1 布南色林對(duì)精神分裂癥大鼠海馬組織病理?yè)p傷的影響HE染色×400A：正常組；B：模型組；C：利培酮組；D：布南色林組

2.4 布南色林對(duì)精神分裂癥大鼠海馬組織PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá)水平的影響與正常組比較，模型組海馬組織PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組比較，布南色林組和利培酮組PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；但布南色林組和利培酮組PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá)水平的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4。

表4 布南色林對(duì)精神分裂癥大鼠海馬組織PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá)水平的影響

2.5 布南色林對(duì)精神分裂癥大鼠海馬組織PI3K/AKT/GSK3β通路蛋白表達(dá)的影響與正常組比較，模型組海馬組織PI3K、AKT和GSK3β磷酸化水平降低(P<0.05)；與模型組比較，布南色林組和利培酮組PI3K、AKT和GSK3β磷酸化水平升高(P<0.05)；但布南色林組和利培酮組PI3K、AKT和GSK3β磷酸化水平的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖2 布南色林對(duì)精神分裂癥大鼠海馬組織PI3K/AKT/GSK3β通路蛋白表達(dá)的影響A：正常組；B：模型組；C：布南色林組；D：利培酮組；與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

精神分裂癥病因復(fù)雜，其臨床研究和治療存在一定局限性，其研究進(jìn)展緩慢，尤其是腦組織不同于其他外周組織易獲取活體樣本，多采用影像學(xué)和腦電生理學(xué)分析，但難以全面闡述其病因及發(fā)病機(jī)制，需構(gòu)建合理的動(dòng)物模型進(jìn)行研究。MK-801是典型非競(jìng)爭(zhēng)性N-甲基-D-天冬氨酸受體阻斷劑，可廣泛參與中樞神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，引發(fā)幻覺(jué)、妄想、感覺(jué)遲鈍等精神分裂癥典型臨床癥狀，還會(huì)誘發(fā)刻板行為、共濟(jì)失調(diào)等行為學(xué)表現(xiàn)，與臨床精神分裂癥的疾病譜基本相符。本研究采用MK-801誘導(dǎo)精神分裂癥大鼠模型，行為學(xué)觀察結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠刻板行為評(píng)分、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總路程及逃避潛伏期升高，穿越平臺(tái)原位置次數(shù)降低，表明模型大鼠出現(xiàn)限制性和重復(fù)性的刻板行為，探索性活動(dòng)減少，學(xué)習(xí)和記憶能力也下降，提示神經(jīng)分裂癥大鼠模型構(gòu)建成功。

布南色林作為非典型抗精神病藥物，對(duì)多巴胺D2、D3受體和5-羥色胺2A受體均有較高的親和力，D3受體可抑制多巴胺的釋放和流出，布南色林可拮抗D3受體，改善情緒、認(rèn)知等功能損傷。而且，布南色林對(duì)5-羥色胺2C、腎上腺素α1、組胺H1等受體的親和力較低，故發(fā)生體質(zhì)量增加、代謝異常、過(guò)度鎮(zhèn)靜等風(fēng)險(xiǎn)也降低。本研究對(duì)精神分裂癥大鼠分別給予布南色林、利培酮灌胃處理后，大鼠認(rèn)知功能障礙及學(xué)習(xí)記憶能力提高，且兩種藥物改善能力相當(dāng)，這與臨床研究[10]結(jié)果相符。進(jìn)一步觀察給藥對(duì)模型大鼠體內(nèi)糖脂代謝的影響，結(jié)果顯示，相同給藥時(shí)間下，利培酮可提高FPG、HbA1c、TG及TC水平，但布南色林對(duì)糖脂代謝指標(biāo)無(wú)明顯的影響，與Mattingly et al[11]報(bào)道一致。同時(shí)，觀察大鼠海馬組織病理?yè)p傷，結(jié)果顯示，MK-801處理后海馬組織出現(xiàn)細(xì)胞排列疏松、細(xì)胞核固縮等明顯病理?yè)p傷，布南色林組和利培酮組上述海馬組織損傷明顯減輕，表明布南色林和利培酮均可減輕MK-801誘導(dǎo)的海馬組織病理?yè)p傷。

關(guān)于精神分裂癥病因的假說(shuō)很多，如多巴胺假說(shuō)、神經(jīng)發(fā)育假說(shuō)等，但該疾病的真正病因尚不清楚?？紤]精神分裂癥具有高遺傳性的特點(diǎn)，本研究從基因?qū)W角度出發(fā)，分析布南色林對(duì)精神分裂癥的改善機(jī)制。PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，且與軸突再生、神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定等密切相關(guān)[12]。PI3K是重要的肌醇和磷酸酰肌醇激酶，磷酸化產(chǎn)物可進(jìn)一步招募并活化AKT，激活的AKT可通過(guò)磷酸化GSK3β，降低GSK3β過(guò)度表達(dá)。馬征 等[13]研究顯示，利培酮可能通過(guò)調(diào)控PI3K/mTOR信號(hào)通路，治療癲癇所致精神障礙。Park et al[14]報(bào)道，奧氮平可激活初級(jí)海馬神經(jīng)元的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白1(mTORC1)及其下游效應(yīng)及上游激活子(PI3K、MEK)的磷酸化，促進(jìn)樹(shù)突生長(zhǎng)和突觸蛋白表達(dá)，從而影響神經(jīng)可塑性。推測(cè)同為非典型抗精神病藥物的布南色林可能對(duì)PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路存在影響；本研究結(jié)果顯示，布南色林治療后，大鼠海馬組織PI3K、AKT和GSK3β磷酸化水平升高，表明布南色林可激活PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路，修復(fù)模型大鼠認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)記憶減退。

綜上所述，布南色林可能通過(guò)激活PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路，修復(fù)精神分裂癥大鼠海馬神經(jīng)元損傷，改善其認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶能力，但對(duì)大鼠糖脂代謝無(wú)明顯影響。