E3泛素連接酶FBXW7在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及對其生物學(xué)行為的影響

何尚峰，盧香云，馬琰迪，孫 琦，高海霞，張洪攀，阿米爾，俞雪燕，禹 潔，王文潔，陳云昭，李 鋒,，崔曉賓,

食管癌(esophageal carcinoma，EC)在全球所有癌癥中發(fā)病率居第七位，病死率居第六位[1]，有兩種主要的組織學(xué)亞型(鱗狀細(xì)胞癌和腺癌)，其中食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國EC中的主要亞型，臨床表現(xiàn)為侵襲性且預(yù)后不良[2]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是介導(dǎo)真核生物蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵組分[3]，主要由3種蛋白質(zhì)組成：泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)，3種酶的共同協(xié)作，完成對底物蛋白的識別及泛素化降解[4]。F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7,FBXW7)作為E3泛素連接酶中RING家族的一員，參與降解多種已知的原癌蛋白，包括c-MYC、Cyclin E、NOTCH、MCL1、mTOR、c-JUN、AURKA，在多種癌癥中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮著重要作用[5]，而FBXW7在ESCC中的作用有待進(jìn)一步研究。該研究旨在探究FBXW7在ESCC中的表達(dá)與生存預(yù)后的關(guān)系，以及FBXW7對ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 本實(shí)驗(yàn)選取2000—2016 年間ESCC石蠟包埋組織樣本共224例。其中癌組織171例，距離ESCC組織3 cm以上部位的癌旁組織53例，患者術(shù)前均未接受過放療或化療。由兩名資深病理醫(yī)師根據(jù)WHO(2019)消化系統(tǒng)腫瘤分類對 HE 切片進(jìn)行復(fù)片，并參照2017年UICC/AJCC 第8版食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。所收集的病例均得到患者的同意并簽署知情同意書。并收集患者的個(gè)人資料、腫瘤分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及 TNM 分期等臨床病理資料，通過電話等對患者進(jìn)行隨訪，截至2020年8月或死亡日期。

1.1.2細(xì)胞株 本實(shí)驗(yàn)所用食管鱗癌細(xì)胞系Eca109和Eca9706均購買自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

1.1.3試劑 FBXW7抗體(貨號：ab109617)購自英國Abcam公司；胎牛血清(foetal bovine serum,FBS)、PBS緩沖液購自以色列BI公司；青鏈霉素混合液(貨號：P1400)、4%組織細(xì)胞固定液(貨號：P1110)、0.1%結(jié)晶紫染色液(貨號：G1063)、5×蛋白上樣緩沖液(貨號：P1040)、1×TBST緩沖液(貨號：T1085)購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；FBXW7質(zhì)粒由蘇州吉瑪基因股份有限公司構(gòu)建；CCK-8 試劑盒(貨號：MI00615)、ECL發(fā)光液(貨號MI00607C)購自米鼠(西安)生物科技有限公司；基質(zhì)膠購自美國Corning公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒(貨號：PG112)、無蛋白快速封閉液(貨號：PS108P)購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；ENO1抗體(貨號：sc-100812)購自美國Santa公司；GAPDH抗體(貨號：AF0006)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根酶標(biāo)記鼠二抗(貨號：ZB-2305)、辣根酶標(biāo)記兔二抗(貨號：ZB-2301)：購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.4主要實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈臺工作臺、-80 ℃冰箱(美國賽默飛世爾科技有限公司)；酶標(biāo)儀(美國ABI公司)；光學(xué)倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；4 ℃冰箱(中國海爾集團(tuán)公司)；ECL Western成像儀(北京百晶生物技術(shù)公司)；電泳儀、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-RAD 公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色及評估 使用 EnVision 兩步法進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，使用FBXW7抗體，調(diào)整抗體稀釋比例為1 ∶8 000。染色結(jié)果評分均由兩位高年資的病理醫(yī)師獨(dú)立雙盲法評定。FBXW7主要定位于細(xì)胞核中，以呈棕黃色顆粒為陽性。計(jì)分方法如下：①按細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分，無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分；②按腫瘤陽性細(xì)胞的百分比計(jì)分，<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；③將著色強(qiáng)度及陽性百分比兩項(xiàng)評分結(jié)果的得分相乘，最終得分≤3分為低表達(dá)，>3分為高表達(dá)。若對結(jié)果存在分歧則請第三位高年資的病理醫(yī)師評定。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將Eca109和Eca9706細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%進(jìn)行換液及傳代處理，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)50萬個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜6～8 h后，每個(gè)EP管中加入100 μl RPMI-1640培養(yǎng)基，再分別加入7.5 μl Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑和2.5 μg FBXW7質(zhì)粒，將兩管混勻后靜置5～10 min，棄去6孔板中原有培養(yǎng)基，用PBS清洗2～3次，將混合液體均勻滴入每個(gè)孔中，4～6 h后進(jìn)行換液，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，消化離心后計(jì)數(shù)。以每孔1 000個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2 ml的培養(yǎng)液，鋪勻細(xì)胞后放入培養(yǎng)箱中，每隔3～4 d換液，培養(yǎng)10 d左右，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，使用PBS清洗2～3次，加入4%組織細(xì)胞固定液于4 ℃固定20 min，PBS清洗去除多余的組織細(xì)胞固定液，0.1%結(jié)晶紫染色液4 ℃染色，20 min后PBS再清洗2次。將培養(yǎng)板置于室溫晾干，在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)每組細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.2.5CCK-8實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，消化離心后計(jì)數(shù)，在96孔板中每孔接種Eca9706細(xì)胞2 000個(gè)，Eca109細(xì)胞每孔接種1 000個(gè)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，并在調(diào)零孔加入培養(yǎng)基，分別在0、24、48、72、96 h于避光條件下每孔加入10 μl CCK-8試劑,37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值，重復(fù)檢測3次，取均值。

1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，待細(xì)胞密度達(dá)到90%左右，用1 ml滅菌槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗滌兩次，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、48 h拍照。

1.2.7Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 消化轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，加入1 ml 1×PBS和RPMI-1640洗滌，用RPMI-1640重懸并計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)整為3×104個(gè)/ml，向上室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入600 μl含20% 胎牛血清的培養(yǎng)基。避免上下室之間氣泡產(chǎn)生，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出。吸棄上、下室培養(yǎng)液，l×PBS清洗2遍，用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動，吸干水分并擦去膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞。下室加入1 ml的4%組織細(xì)胞固定液4 ℃固定20 min，用棉簽擦拭上室內(nèi)部。棄去下室液體，并加入0.1%結(jié)晶紫染色液，4 ℃染色20 min，用PBS洗去結(jié)晶紫染色液，用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動，吸干上室水分。倒置顯微鏡上放置載玻片，將小室放在上面進(jìn)行拍照。

1.2.8Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 侵襲實(shí)驗(yàn)前需提前準(zhǔn)備基質(zhì)膠，將-80 ℃分裝保存的基質(zhì)膠，于實(shí)驗(yàn)前12 h、4 ℃融化，用無血清培養(yǎng)液RPMI-1640按照1 ∶8的比例稀釋，每孔加入45 μl(在冰上進(jìn)行)，37 ℃孵育箱2 h使其凝固，吸棄多余液體，后續(xù)步驟同于遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.9Western blot實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前根據(jù)PAGE凝膠快速制備試劑盒說明書制備PAGE凝膠，將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞用PBS清洗2～3次，蛋白提取全程在冰上進(jìn)行，加入5×蛋白上樣緩沖液100 ℃煮沸10 min，電泳后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，無蛋白快速封閉液封閉1 h，加入一抗孵育盒4 ℃過夜(FBXW7稀釋比例1 ∶1 000；ENO1稀釋比例1 ∶1 000；GAPDH稀釋比例1 ∶1 000)，1× TBST緩沖液清洗5 min×6次，加入二抗孵育盒室溫孵育2 h(辣根酶標(biāo)記鼠二抗稀釋比例1 ∶8 000；辣根酶標(biāo)記兔二抗稀釋比例為1 ∶10 000)，1×TBST清洗5 min×6次，使用ECL發(fā)光液顯色。

2 結(jié)果

2.1 FBXW7在ESCC組織及癌旁組織中蛋白表達(dá)水平FBXW7在ESCC組織及癌旁組織中均出現(xiàn)核膜的染色，但在核仁中的染色有顯著差異，在ESCC組織中的蛋白表達(dá)水平低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。見圖1和表1。

表1 FBXW7在癌旁組織和ESCC組織中的蛋白表達(dá)水平(n)

圖1 癌旁組織與ESCC組織中FBXW7蛋白表達(dá)情況 A、B：癌旁組織免疫組織化學(xué)染色情況 ×40、×200；C、D：ESCC組織免疫組織化學(xué)染色情況 ×40、×200

2.2 FBXW7表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)前期隨訪數(shù)據(jù)，將有臨床病理相關(guān)資料的73例ESCC患者根據(jù)免疫組化評分(immunohistochemical score，IS)進(jìn)行分組，IS≤3分為低表達(dá)，IS>3分為高表達(dá)，表2統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，F(xiàn)BXW7低表達(dá)的腫瘤分化程度更低(P=0.011)，F(xiàn)BXW7高表達(dá)的ESCC患者TNM分期更早(P=0.032)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而與患者的性別、年齡、部位、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理資料的關(guān)系差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 FBXW7的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3 FBXW7與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系在224例ESCC患者中，有63例患者通過電話隨訪、醫(yī)院記錄等方式獲得完整的隨訪信息，截止日期為2020年8月或死亡日期。通過Kaplan-Meier生存分析ESCC患者FBXW7蛋白表達(dá)水平與生存期及存活情況的關(guān)系，生存曲線結(jié)果顯示，F(xiàn)BXW7低表達(dá)組的生存時(shí)間短于FBXW7高表達(dá)患者，F(xiàn)BXW7低表達(dá)組的預(yù)后顯著差于FBXW7高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)。見圖2。

圖2 FBXW7的表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的生存分析曲線

2.4 FBXW7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染最佳比例Eca9706細(xì)胞系中，分別使用不同F(xiàn)BXW7質(zhì)粒 ∶Lipofectamine2000比例在6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，F(xiàn)BXW7質(zhì)粒加入2.5 μg，Lipofectamine2000分別加入0、5、7.5、10 μl，分為1 ∶0、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4的濃度梯度，轉(zhuǎn)染48 h后通過Western blot檢測FBXW7蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示FBXW7質(zhì)粒 ∶Lipofectamine2000的比例為1 ∶2 或者1 ∶3時(shí)，過表達(dá)效果較好，Eca109細(xì)胞系中使用相同比例進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖3。

圖3 Western blot檢測Eca9706細(xì)胞系中不同比例轉(zhuǎn)染FBXW7質(zhì)粒后蛋白表達(dá)水平a：1 ∶0組；b：1 ∶2組；c：1 ∶3組；d：1 ∶4組

2.5 過表達(dá)FBXW7對ESCC細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測顯示，接種細(xì)胞后第3天開始,在Eca9706和Eca109細(xì)胞中，過表達(dá)FBXW7組的吸光度值開始低于對照組，到達(dá)第5天時(shí)，Eca9706細(xì)胞系中，過表達(dá)FBXW7組吸光度值低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=172.100,P<0.001)，Eca109細(xì)胞系中，過表達(dá)FBXW7組吸光度值也低于對照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=241.101,P<0.001)(圖4)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Eca9706細(xì)胞中，過表達(dá)FBXW7組細(xì)胞集落數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.078，P<0.001)；Eca109細(xì)胞中，過表達(dá)FBXW7組細(xì)胞集落數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.160，P<0.001)，上述結(jié)果提示FBXW7 可以抑制ESCC細(xì)胞的增殖能力。見圖5。

圖4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測Eca9706和Eca109細(xì)胞的增殖能力a:Eca9706細(xì)胞；B:Eca109細(xì)胞；與對照組比較：***P<0.001

圖5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測Eca9706和Eca109細(xì)胞的增殖能力與對照組比較：***P<0.001

2.6 過表達(dá)FBXW7對ESCC細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示劃痕結(jié)束48 h后，Eca9706細(xì)胞系中，過表達(dá)FBXW7組的細(xì)胞遷移率低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.822，P<0.001)。Eca109細(xì)胞系中，過表達(dá)FBXW7組的細(xì)胞遷移率低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.015，P<0.001)(圖6)。Transwell細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)分別于鋪完小室24、48 h后進(jìn)行固定染色和拍照，結(jié)果顯示，在Eca9706細(xì)胞中，過表達(dá)FBXW7組的細(xì)胞遷移數(shù)目低于對照組的細(xì)胞遷移數(shù)目，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.326，P<0.001)，過表達(dá)FBXW7組的細(xì)胞侵襲數(shù)目低于對照組的細(xì)胞侵襲數(shù)目，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.959，P<0.001)。在Eca109細(xì)胞中，過表達(dá)FBXW7組的細(xì)胞遷移數(shù)目低于對照組的細(xì)胞遷移數(shù)目，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.034，P<0.001)，過表達(dá)FBXW7組的細(xì)胞侵襲數(shù)目低于對照組的細(xì)胞侵襲數(shù)目，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.579，P<0.001)(圖7)。以上結(jié)果均表明FBXW7可以抑制ESCC細(xì)胞Eca9706和Eca109的遷移、侵襲。

圖6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測Eca9706和Eca109細(xì)胞的遷移能力A：Eca9706細(xì)胞中過表達(dá)FBXW7組與對照組劃痕實(shí)驗(yàn)情況；B：Eca109細(xì)胞中過表達(dá)FBXW組與對照組劃痕實(shí)驗(yàn)情況；與對照組比較：***P<0.001

圖7 Transwell細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測Eca9706和Eca109細(xì)胞的遷移、侵襲能力A：Eca9706細(xì)胞中過表達(dá)FBXW7組與對照組遷移侵襲情況；B：Eca109細(xì)胞中過表達(dá)FBXW7組與對照組遷移侵襲情況；與對照組比較：***P<0.001

3 討論

FBXW7作為E3泛素連接酶中的一員，通過促進(jìn)多種癌蛋白的降解來發(fā)揮其腫瘤抑制作用[6]。其功能的發(fā)揮需要依賴SCF(SKP1/CUL1/F-box)復(fù)合體的形成，它包含一個(gè)CULLIN家族支架蛋白，該蛋白與具有催化活性的RING finger(RBX1)結(jié)合，RBX1可以招募E2泛素結(jié)合酶(UBC)和SKP1，后者與F-box相互作用，F(xiàn)-box蛋白作為底物識別亞單位發(fā)揮作用[7]。目前，F(xiàn)BXW7在ESCC中的表達(dá)及其對ESCC細(xì)胞生物學(xué)行為影響的相關(guān)研究尚不多見，有報(bào)導(dǎo)提出miR-25可以通過抑制FBXW7靶向NOTCH1，進(jìn)而促進(jìn)ESCC細(xì)胞的侵襲和遷移[8-9]，另外，miR-223也可以負(fù)向調(diào)控FBXW7，其高表達(dá)及FBXW7低表達(dá)與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)[10]，部分文獻(xiàn)也報(bào)導(dǎo)FBXW7的低表達(dá)與患者不良預(yù)后呈正相關(guān)[11]，且與化療敏感性相關(guān)[12]。

本研究首先檢測了ESCC石蠟組織樣本與癌旁石蠟組織樣本中FBXW7的表達(dá)情況，結(jié)果顯示FBXW7在ESCC組織及癌旁組織中均有核膜的表達(dá)，ESCC組織中核仁的表達(dá)低于癌旁組織，文獻(xiàn)[5-6]提出FBXW7在多種腫瘤中作為抑癌基因降解癌蛋白，該作用大多是在核內(nèi)發(fā)生，這與本研究FBXW7在核仁中差異定位的結(jié)果相一致，而核膜中普遍的著色提示FBXW7在核膜的定位可能與其抑癌功能無關(guān)。結(jié)合ESCC患者的臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)相較于低分化患者，在中到高分化患者中FBXW7的表達(dá)明顯更高，此外，F(xiàn)BXW7表達(dá)水平還與ESCC患者TNM分期相關(guān)，并且在Ⅰ+Ⅱ期中表達(dá)更高。腫瘤的分化程度和病理學(xué)分期是目前用來評估腫瘤生物學(xué)行為和診斷的重要的指標(biāo)，主要用于惡性腫瘤生物學(xué)行為和預(yù)后的評估，對ESCC患者的生存分析也表明，F(xiàn)BXW7高表達(dá)組患者的生存預(yù)后明顯優(yōu)于FBXW7低表達(dá)組，以上研究結(jié)果提示FBXW7在ESCC中可能發(fā)揮抑癌作用。為了進(jìn)一步探究FBXW7對ESCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，使用過表達(dá)的FBXW7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩株ESCC細(xì)胞系(Eca109和Eca9706)，CCK-8實(shí)驗(yàn)以及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，過表達(dá)FBXW7組的Eca109和Eca9706細(xì)胞增殖能力發(fā)生了顯著的下降，同時(shí)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，過表達(dá)FBXW7組中，兩株ESCC細(xì)胞的遷移能力及侵襲能力也均出現(xiàn)明顯減弱。

綜上所述，F(xiàn)BXW7可能通過抑制ESCC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移的能力，進(jìn)而影響ESCC的發(fā)展。結(jié)合既往文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，推測FBXW7在ESCC中同樣是通過靶向降解某種癌蛋白，發(fā)揮其抑癌作用。