芍藥苷抑制NLRP3炎癥小體通路對db/db小鼠肝臟炎癥和纖維化的影響

王安麗，朱啟金，吳永貴，夏玲玲

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)已成為危害公眾健康的重要健康問題。糖尿病引起的肝臟損傷統(tǒng)稱為糖尿病性肝損傷，糖尿病性肝損傷主要表現(xiàn)為肝功能異常、非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)、肝纖維化[1-2]。芍藥苷(paeoniflorin, PF)是白芍總苷的主要有效成分，大量研究[3]表明PF具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。PF對多種肝臟損傷有潛在的保護作用，包括肝缺血再灌注損傷、中毒性化學誘導的肝損傷、肝纖維化和NAFLD[3]。此外，PF通過ROCK/NF-κB、IRS/Akt/GSK3β和LKB1/AMPK信號通路減少NAFLD中的脂肪變性、炎癥和壞死[4-5]。前期研究[6]表明，白芍總苷可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激減輕1型糖尿病小鼠的肝臟損傷。研究[7-8]表明NOD樣受體蛋白-3(NOD-like receptor 3，NLRP3)炎癥小體通路在糖尿病性肝損傷的炎癥和纖維化中發(fā)揮關鍵作用。PF可抑制糖尿病足潰瘍中NLRP3炎癥小體通路的激活[9]。該研究旨在探討在db/db小鼠的肝臟損傷中，PF對NLRP3炎癥小體通路介導的炎癥和纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組雄性db/db小鼠24只(6～8周齡，30～40 g/只)和雄性db/m小鼠12只(6～8周齡，20～25 g/只)購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2018-0008，使用許可證號：SYXK(蘇)2018-0027。動物實驗均在安徽醫(yī)科大學SPF級動物實驗室進行，飼養(yǎng)條件為(22±2) ℃、濕度60%，明暗周期為12 h/12 h，自由進食和飲水。以db/db小鼠為2型糖尿病小鼠模型，以db/m小鼠為正常對照。后者隨機分為正常對照(db/m)組、正常對照+PF(PF)組；前者隨機分為糖尿病(db/db)組、糖尿病+PF 25 mg/kg(db/db+PF 25 mg/kg)組、糖尿病+PF 50 mg/kg(db/db+PF 50 mg/kg)組、糖尿病+PF 100 mg/kg(db/db+PF 100 mg/kg)組。db/db+PF組小鼠每天灌胃PF 1次，PF組每天灌胃100 mg/kg的PF，db/m組和db/db組給予適量生理鹽水，共12周。該研究已獲得安徽醫(yī)科大學動物倫理委員會批準(NO:LLSC20190519)。

1.2 試劑PF(純度：≥98%)購自上海麥克林生化科技有限公司；抗β-actin、抗Col Ⅲ的特異性抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；抗F4/80特異性抗體購自美國Abcam公司；抗Caspase-1特異性抗體購自美國Abclonal公司；抗NLRP3、抗IL-1β特異性抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；抗TNF-α、抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)特異性抗體購自新竹市Arigo公司；抗IL-18、抗ASC特異性抗體購自美國Affinity公司；總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、非酯化游離脂肪酸(free fat acid,FFA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；油紅O染色試劑盒購自北京索萊寶；HRP標記的山羊抗兔/小鼠IgG二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；拜安康血糖試紙購自德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司。

1.3 主要儀器石蠟包埋機、石蠟切片機和冰凍切片機購自德國Lecia公司；多功能酶標儀購自美國PE公司；BX50光學顯微鏡購自日本OLYPUS公司；電泳儀和濕轉(zhuǎn)儀購自美國伯樂公司；熒光顯影系統(tǒng)Li-Cor/Odyssey購自美國LI-COR Biosciences公司；拜安康血糖測試儀購自德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司。

1.4 方法

1.4.1一般生化指標的檢測 稱量并記錄小鼠的體質(zhì)量。剪去小鼠尾尖，采小鼠尾尖血通過血糖儀測量小鼠血糖。小鼠灌胃PF 12周后，吸入5%異氟醚麻醉小鼠，收集血清樣本，按照說明書檢測血清ALT、AST、TC、TG、和FFA水平。取出小鼠肝臟組織，用紗布吸干組織表明多余水分，稱量肝臟的重量并計算肝質(zhì)量與體質(zhì)量的比值。對于肝臟組織TC、TG和FFA水平的檢測參考說明書步驟進行。

1.4.2肝臟組織病理形態(tài)學觀察 肝臟組織用4%多聚甲醛固定，脫水后包埋在石蠟中，切成4 μm厚切片，按照說明書進行HE染色和天狼星紅染色。對于油紅O染色，肝臟組織在30%蔗糖溶液中固定和脫水，OCT包埋，切成10 μm的切片，根據(jù)說明書，用油紅O染色試劑盒對切片進行染色。

1.4.3免疫組化染色 石蠟切片于烘箱中70 ℃加熱至蠟融化，依次浸泡于二甲苯和梯度乙醇中。滴加內(nèi)源性過氧化氫酶阻斷劑覆蓋組織，室溫靜置20 min。使用檸檬酸鹽進行微波加熱修復抗原。隨后10%山羊血清在37 ℃封閉1 h。滴加抗F4/80(1 ∶200)、抗Ⅲ型膠原( collagen Ⅲ, Col Ⅲ)(1 ∶200)和抗α-SMA(1 ∶200)在4 ℃孵育過夜，然后加入二抗37 ℃、45 min。PBS沖洗，DAB染色，在顯微鏡下觀察載玻片并拍照。使用Image J分析圖片，計算陽性面積百分比。

1.4.4Western blot實驗 取適量肝臟組織，加入裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)提取蛋白，并進行BCA蛋白定量分析。蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。配制1×快速封閉液，封閉15～30 min后將膜分別放入抗β-actin(1 ∶5 000)、抗NLRP3(1 ∶1 000)、抗ASC(1 ∶1 000)、抗Caspase-1(1 ∶1 000)、抗IL-1β(1 ∶1 000)、抗IL-18(1 ∶1 000)和抗TNF-α(1 ∶1 000)一抗中4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次10 min。加入HRP標記的山羊抗兔/小鼠IgG二抗(1 ∶5 000)孵育50 min。TBST洗膜3次，使用化學發(fā)光系統(tǒng)曝光條帶。使用Image J測量條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 PF對小鼠一般指標的影響與db/m組相比，db/db組小鼠肝質(zhì)量/體質(zhì)量(P<0.01)和血糖(P<0.001)升高；與db/db組相比，db/db+PF組肝質(zhì)量/體質(zhì)量和血糖無明顯變化。檢測ALT和AST水平顯示，與db/m組相比，PF組ALT、AST水平近似，db/db組ALT、AST上升(P<0.001)；與db/db組相比，db/db+PF組ALT、AST水平下降(P<0.001)。與db/m組相比，PF組血清及肝臟組織中TC、TG和FFA水平相近，差異無統(tǒng)計學意義，而db/db組升高(P<0.001)；與db/db組相比，db/db+PF組血清及肝臟組織中TC、TG和FFA水平下降(P<0.05)。見表1。

表1 PF對db/db小鼠一般指標的影響

2.2 PF對小鼠肝組織病理形態(tài)的影響HE染色結(jié)果顯示，db/m組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，小葉結(jié)構(gòu)完整、肝細胞以中央靜脈為中心向四周放射狀排列、細胞形態(tài)清晰，而db/db組小鼠肝小葉排列紊亂、細胞空泡樣變性、大量炎癥細胞浸潤。與db/db組相比，db/db+PF組小鼠肝細胞空泡樣變減少、炎癥細胞浸潤減少，PF治療逆轉(zhuǎn)了上述病理改變，見圖1A。通過肝臟組織油O染色結(jié)果顯示，與db/m組相比，db/db組小鼠肝組織中可以觀察到大量的脂滴；與db/db組相比，db/db+PF組脂滴減少，見圖1B。肝臟組織天狼星紅染色顯示：與db/m組相比，db/db組小鼠肝臟組織膠原沉積增加；與db/db組相比，db/db+PF組膠原沉積減少，見圖1C。

圖1 PF對db/db小鼠肝臟組織病理改變的影響A：HE染色觀察PF對各組肝臟一般病理形態(tài)的影響 ×400；B：油紅O染色觀察PF對db/db小鼠肝臟組織脂質(zhì)堆積的影響 ×200；C：天狼星紅染色觀察PF對db/db小鼠肝臟組織膠原沉積的影響 ×400；a:db/m組；b:PF組；c:db/db組；d:db/db+PF 25 mg/kg組；e:db/db+PF 50 mg/kg組；f:db/db+PF 100 mg/kg組

2.3 PF對小鼠肝組織炎癥的影響Western blot檢測IL-1β、IL-18和TNF-α，與db/m組相比，PF組肝臟組織IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，db/db組炎癥因子(IL-1β、IL-18和TNF-α)的表達均升高(P<0.001)；db/db+PF組炎癥因子的表達與db/db組相比均下降(PIL-1β<0.001；PIL-18<0.05；PTNF-α<0.05)。結(jié)果表明db/db小鼠肝臟組織炎癥反應增加，PF可以減輕db/db小鼠肝臟炎癥反應。見圖2A。免疫組化檢測肝臟組織F4/80的表達，相較于db/m組，db/db組肝臟組織F4/80的表達升高(P<0.01)；與db/db組相比，db/db+PF組肝臟組織F4/80表達下降(P<0.01)。結(jié)果提示db/db小鼠肝臟組織巨噬細胞浸潤增加，而PF減少了巨噬細胞的浸潤。見圖2B。

圖2 PF對db/db小鼠肝臟炎癥反應的影響A：Western blot法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織IL-1β、IL-18和TNF-α表達的影響；B：免疫組化法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織F4/80表達的影響 ×400；a:db/m組；b:PF組；c:db/db組；d:db/db+PF 25 mg/kg組；e:db/db+PF 50 mg/kg組；f:db/db+PF 100 mg/kg組；與db/m組比較：**P<0.01，***P<0.001；與db/db組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.4 PF對小鼠肝臟纖維化的影響免疫組化檢測各組肝臟組織α-SMA和Col Ⅲ的表達，與db/m組相比，PF組肝臟組織α-SMA和 Col Ⅲ表達差異無統(tǒng)計學意義，db/db組肝臟組織α-SMA和Col Ⅲ的表達升高(P<0.01)；與db/db組相比，db/db+PF組肝臟組織α-SMA和Col Ⅲ表達下降(P<0.01)。提示db/db小鼠肝星狀細胞活化增加，肝臟組織纖維化增加，而芍藥苷抑制了糖尿病性肝損傷的纖維化。見圖3。

圖3 免疫組化法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織α-SMA和Col Ⅲ表達的影響 ×400A：免疫組化法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織α-SMA表達的影響；B：免疫組化法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織Col Ⅲ表達的影響；a:db/m組；b:PF組；c:db/db組；d:db/db+PF 25 mg/kg組；e:db/db+PF 50 mg/kg組；f:db/db+PF 100 mg/kg組；與db/m組比較：**P<0.01；與db/db組比較：##P<0.01

2.5 PF對小鼠肝臟NLRP3炎癥小體通路的影響Western blot檢測各組肝臟組織NLRP3、ASC和Caspase-1的表達，與db/m組相比，db/db組NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表達均升高(P<0.001)；與db/db組相比，db/db+PF組這些蛋白的表達均下降(PNLRP3<0.001，PASC<0.05，PCaspase-1<0.05)。結(jié)果表明db/db小鼠肝臟NLRP3炎癥小體通路激活增加，芍藥苷可以抑制db/db小鼠肝臟NLRP3通路的激活。見圖4。

圖4 Western blot法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織NLRP3、ASC和Caspase-1表達的影響a:db/m組；b:PF組；c:db/db組；d:db/db+PF 25 mg/kg組;e:db/db+PF 50 mg/kg組;f:db/db+PF 100 mg/kg組；與db/m組比較：***P<0.001；與db/db組比較：#P<0.05，###P<0.001

3 討論

糖尿病性肝損傷是糖尿病的一種并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為NAFLD。據(jù)報道，糖尿病性肝損傷發(fā)生時，肝臟病理發(fā)生明顯改變，肝細胞脂質(zhì)堆積、肝臟炎癥細胞浸潤，隨著疾病進展導致肝纖維化以及肝臟組織不可逆損傷[2, 8]。糖尿病肝臟的炎癥和纖維化主要通過脂毒性介導，2型糖尿病通常伴有胰島素抵抗，由胰島素抵抗引起的高胰島素血癥會促進脂質(zhì)在肝細胞中的積累，受損肝細胞產(chǎn)生自由基和釋放損傷相關模式分子(DAMP)，激活枯否細胞和肝星狀細胞(HSC)，導致炎癥和纖維化，除了肝細胞損傷的間接影響外，高胰島素血癥可能直接激活HSC[10]。糖尿病患者的肝纖維化在使用藥物治療后或在體質(zhì)量明顯減輕后(嚴重肥胖患者)是可逆的。因此，研究糖尿病性肝損傷的發(fā)病機制，找到治療糖尿病性肝損傷的藥物非常重要。

在長期的高血糖環(huán)境下，肝細胞表現(xiàn)為大泡性脂肪滴聚集、氣球樣變，肝細胞中脂質(zhì)堆積導致肝臟脂肪病變，脂質(zhì)過氧化，促炎細胞因子釋放，促進肝星狀細胞活化導致肝臟纖維化的發(fā)生[8]。有文獻表明，即使在正常飲食條件下，db/db小鼠也表現(xiàn)出肝臟脂質(zhì)積累、炎癥細胞浸潤以及纖維化[7, 11-12]。該研究表明db/db小鼠肝臟脂質(zhì)堆積、炎癥細胞浸潤及輕度的纖維化。

PF是一種具有多種藥理活性的傳統(tǒng)中藥，其抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用已經(jīng)被公認[3]。該研究表明，PF治療后糖尿病小鼠的ALT和AST下降，然而PF不改變db/db小鼠血糖，表明PF不是通過降低血糖來發(fā)揮保護肝臟的作用。此外，PF還能改善肝臟組織的病理損傷。進一步研究表明，PF能夠降低糖尿病小鼠肝臟炎癥細胞因子(IL-1β、IL-18、TNF-α)的水平。db/db小鼠肝臟組織α-SMA表達升高，而PF治療減少了α-SMA蛋白的表達。同時，該研究結(jié)果顯示，db/db小鼠肝臟組織Col Ⅲ表達升高，PF處理降低了Col Ⅲ蛋白的表達水平。這些結(jié)果說明芍藥苷對db/db小鼠肝臟損傷具有抗炎和抗纖維化作用。

已有研究[7-8, 13]表明NLRP3炎癥小體通路與糖尿病性肝損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關。NLRP3激活后，促進Pro-caspase-1分裂為活化的Caspase-1，隨后活化的Caspase-1催化pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟[14]。成熟的IL-1β和IL-18促進肝星狀細胞的活化，進而導致肝纖維化的發(fā)生[15]。抑制NLRP3炎癥小體通路的激活可以降低糖尿病性肝損傷的炎癥反應和纖維化。據(jù)報道[7]，褪黑激素通過抑制NLRP3通路從而改善db/db小鼠肝臟的脂肪變性、炎癥反應和纖維化。因此，阻斷NLRP3炎癥小體通路的激活可能可以減輕db/db小鼠的肝臟損傷，從而減輕糖尿病性肝損傷。先前的研究[9]報道，在糖尿病足潰瘍中，PF可通過抑制NLRP3通路的激活減輕炎癥反應。該研究評估了PF對NLRP3炎癥小體通路的影響，結(jié)果證實了芍藥苷可以抑制db/db小鼠肝臟中NLRP3炎癥小體通路的激活。

綜上所述，研究表明PF抑制了NLRP3炎癥小體通路并減輕了db/db小鼠肝臟炎癥反應及纖維化。PF治療后，明顯改善了db/db小鼠肝臟功能和病理改變。因此，PF在糖尿病性肝損傷的治療上有潛在的可能性。該研究僅從體內(nèi)實驗初步探討PF對糖尿病性肝損傷具有保護作用，但PF調(diào)控NLRP3炎癥小體具體機制尚不明確，有待進一步探討。