ZnxNi1-xS@DOX納米結構用于腫瘤光熱-化學療法聯合治療

金芊芊，馬許可，朱雪瑞，查正寶，錢海生

惡性腫瘤極大地危害著人們的生命健康[1-3]。傳統的癌癥治療方法如外科手術、放療等，均存在一定副作用，無法取得令人滿意的治療效果[4-6]。近年來，光熱療法(photothermal therapy，PTT)因其高特異性、微創性等優勢受到廣泛關注。在近紅外(near-infrared，NIR)光作用下，PTT主要利用光熱劑將吸收的光能轉換成熱量，使治療區域溫度升高，從而實現腫瘤組織的消融[7-8]。PTT也存在一定的局限性，有必要聯合多種方法實現腫瘤的有效治療。該研究通過溶劑熱法成功合成了ZnxNi1-xS空心納米結構，基于其優異的光熱性能和獨特的中空結構，進一步負載阿霉素(doxorubicinol，DOX)得到了ZnxNi1-xS@DOX納米結構，基于光熱-化學療法聯合研究其抗腫瘤功效，為探究腫瘤的新型治療方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器紫外-可見分光光度計(U-5100，日立高新技術公司)；熒光光譜儀(FLS980，英國Edinburgh公司)；X射線光電子能譜儀(ESCALAB250Xi，美國Thermo Scientific公司)；透射電子顯微鏡(JEM-2100F)、場發射掃描電子顯微鏡(SU8020)(日本日立公司)；酶標儀(ELx800，美國伯騰儀器有限公司)；紅外熱成像儀(Testo 869，瑞徽電子上海有限公司)。四水合乙酸鎳(C4H6NiO·4H2O)、乙二醇(C2H6O2)均購于上海國藥集團化學試劑有限公司；阿霉素(C27H29NO11)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 ZnxNi1-xS空心納米結構的合成根據已報道的方法制備了ZnS納米球[7-8]，將其作為模板，通過溶劑熱方法合成了ZnxNi1-xS空心納米球。在20 ml乙二醇中加入ZnS(40 mg)，超聲10 min得到分散均勻的溶液，隨后加入5 ml乙酸鎳(0.64 mmol)的乙二醇分散液，室溫攪拌20 min后，于高壓反應釜中140 ℃反應4 h。等待反應結束之后，關閉烘箱，使其自然降溫，離心收集產物。

1.3 ZnxNi1-xS空心納米結構的光熱性能研究配制不同濃度的ZnxNi1-xS水溶液(0、30、60、90、120、150 μg/ml)，在NIR光照射下(808 nm, 2.0 W/cm2，10 min)，使用紅外熱成像儀(Testo 869)每隔10 s記錄溶液溫度變化并采集對應的紅外熱成像圖片。為了進一步評估激光功率對光熱性能的影響，使用不同功率NIR光(1.0、1.5、2.0 W/cm2)照射ZnxNi1-xS(150 μg/ml)水溶液并記錄實時溫度變化。

1.4 ZnxNi1-xS@DOX納米結構的合成避光條件下，將已合成的ZnxNi1-xS空心納米球(5 mg)分散在10 ml DOX溶液中(5 mg)，攪拌24 h后，用去離子水洗去未反應的DOX，離心至上清液無色，冷凍干燥后可得ZnxNi1-xS@DOX納米結構。

1.5 DOX標準曲線測定使用10 ml容量瓶配置一系列濃度的DOX水溶液(1、2、3、4、5、6 μg/ml)，通過熒光光譜儀測定其熒光強度(激發波長476 nm, 發射波長范圍510～600 nm)，通過線性擬合可得到DOX標準曲線。

1.6 ZnxNi1-xS@DOX藥物釋放研究將1 ml的ZnxNi1-xS@DOX溶液(1×103mg/L)裝載于截留分子量為8 000～14 000的透析袋中，隨后將其置于裝有30 ml不同pH的PBS(pH=5.0、6.5、7.4)緩沖液中，于恒溫搖床中震蕩并在不同時間節點取樣，通過熒光光譜儀測量介質溶液熒光強度，從而確定其濃度。此外，還通過改變恒溫搖床溫度(37、45 ℃)探究溫度對藥物釋放的影響。為了研究光響應的DOX釋放行為，將1 ml的ZnxNi1-xS@DOX溶液(1×103mg/L)溶液置于黑暗條件下作為對照組，同時對另一實驗組用808 nm激光器照射1 ml的ZnxNi1-xS@DOX溶液(1×103mg/L)。每照射5 min后將溶液離心，收集上清液測定其熒光強度，隨后補充新鮮的PBS溶液，重新分散后在黑暗條件下保持相同時間，繼續離心收集上清液，重復此操作多次，分析其藥物釋放效果。

1.7 體外生物安全性評價使用人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)來評價ZnxNi1-xS空心納米結構的生物安全性。在96孔板中，接種處于對數生長期的HUVECs細胞(1×104個細胞/孔)，在恒溫培養箱中孵育1 d，然后加入不同濃度材料(0、20、40、60、80、100 μg/ml)繼續培養24 h。最后加入MTT孵育4 h，使用150 μl二甲亞砜(DMSO)替換上層液體，測量490 nm處的吸光度值。

1.8 ZnxNi1-xS@DOX納米結構的體外抗腫瘤效果檢測以小鼠乳腺癌細胞(mouse breast cancer cells, 4T1)為模型，通過MTT實驗來評估ZnxNi1-xS@DOX 納米結構對腫瘤細胞的殺傷能力。操作過程同上。對于光照組，使用NIR光照射3 min(808 nm，2.0 W/cm2)。

2 結果

2.1 ZnxNi1-xS空心納米結構的形貌表征掃描電鏡圖像及透射電鏡圖像均顯示ZnxNi1-xS空心納米結構分散性良好且尺寸均一，平均直徑約為300 nm，見圖1A、B。掃描透射電子顯微鏡圖像顯示，Zn、Ni和S元素均勻的分布在ZnxNi1-xS空心納米球上，見圖1C～F。

圖1 ZnxNi1-xS納米結構的形貌表征a:ZnxNi1-xS納米結構的掃描電鏡圖像 ×16 000；B: ZnxNi1-xS納米結構的透射電鏡圖像 ×15 000；C:ZnxNi1-xS納米結構的掃描透射電子顯微鏡圖像 ×200 000；D:Zn元素分布圖 ×200 000；E:Ni元素分布圖 ×200 000；F:S元素分布圖 ×200 000

2.2 ZnxNi1-xS空心納米結構的粒徑測量和元素分析ZnxNi1-xS空心納米結構的水合粒徑約為317.98 nm，見圖2A。通過X射線光電子能譜儀對ZnxNi1-xS中Ni、Zn和S元素進行分析。Zn 2p 1/2和Zn 2p 3/2軌道分別與1 043.25 eV和1 022.43 eV處的結合能相對應。874.03 eV和857.01 eV處的結合能分別對應Ni 2p 1/2和Ni 2p 3/2軌道，并在881.58 eV和863.05 eV處觀察到對應的衛星峰。此外，在162.21 eV及在168.76 eV處的結合能分別對應S 2p軌道及S-O鍵。見圖2B～D。

圖2 ZnxNi1-xS納米結構的水合粒徑分布和元素圖譜a:水合粒徑分布；B:Zn 2p X射線光電子能譜圖；C:Ni 2p X射線光電子能譜圖；D:S 2p X射線光電子能譜圖

通過能量色散X射線光譜儀(energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX)對ZnxNi1-xS中Ni、Zn和S元素進行測定，結果見圖3。Zn、Ni及S元素均存在于ZnxNi1-xS空心納米結構中，具體的元素含量見表1，由此計算可得Zn ∶Ni ∶S的原子組成百分比約為1.64 ∶1 ∶1.78。

圖3 ZnxNi1-xS納米結構的EDX能譜

表1 ZnxNi1-xS納米結構的EDX元素比例分析(%)

2.3 ZnxNi1-xS空心納米結構光熱效應ZnxNi1-xS納米結構表現出良好的光熱升溫效果，其光熱性能具有濃度依賴性，見圖4A、B。溶液濃度保持不變時(150 μg/ml)，激光功率越大，溶液溫度越高，光熱效果隨著激光功率的增大而增強，見圖4C。

圖4 ZnxNi1-xS納米結構的光熱性能研究a:不同濃度的ZnxNi1-xS溶液在NIR光照射(808 nm, 2 W/cm2)下的溫度；B:對應的紅外熱成像圖；C:不同功率NIR光照射下ZnxNi1-xS溶液的溫度

2.4 ZnxNi1-xS@DOX 納米結構的合成紫外-可見吸收光譜顯示，ZnxNi1-xS可成功負載DOX分子，見圖5A。為了確定載藥量，將ZnxNi1-xS和DOX反應后離心的上清液收集并測量其熒光強度，并與標準曲線進行比對，見圖5B、C。通過計算可得載藥率約為23.54%。

2.5 ZnxNi1-xS@DOX納米結構中DOX的響應釋放探究了溫度和pH值對ZnxNi1-xS@DOX納米結構中DOX釋放行為的影響。結果顯示，DOX的釋放率隨pH降低、溫度升高而增加。當介質pH為5.0，溫度升高至45 ℃時，ZnxNi1-xS@DOX納米結構中DOX的釋放率可達到約60%，見圖5D、E。接著研究了在NIR光驅動下的藥物釋放行為，在NIR激光器打開狀態下，DOX的釋放速率明顯高于黑暗條件下的釋放率，見圖5F。

圖5 ZnxNi1-xS@DOX納米結構的藥物響應釋放研究a:樣品的紫外-可見吸收光譜；B:不同濃度DOX的熒光光譜；C:對應的標準曲線；D、F:不同溫度、pH下DOX的釋放曲線；F:NIR光照射下DOX的釋放曲線

2.6 ZnxNi1-xS空心納米結構的生物安全性評價通過細胞MTT實驗評估了ZnxNi1-xS空心納米結構的生物安全性。與對照組相比，實驗組HUVECs細胞的存活率整體均高于80%，見圖6，差異有統計學意義(F=15.04，P<0.001)。這表明ZnxNi1-xS納米粒子具有良好的生物安全性。

圖6 不同濃度ZnxNi1-xS納米顆粒與HUVECs共同培養24 h細胞存活率與0 μg/ml比較：*P<0.05，***P<0.001

2.7 ZnxNi1-xS@DOX納米結構的體外抗腫瘤效果檢測當用NIR光照射時，隨著ZnxNi1-xS@DOX濃度的增加，4T1細胞存活率逐漸降低。當濃度為100 μg/ml時，4T1細胞存活率僅為10%左右，表明ZnxNi1-xS@DOX能有效殺傷腫瘤細胞。而同等條件下無NIR光照射時，4T1的存活率保持在70%附近，見圖7。同等濃度下，比較有無NIR光照射時的細胞存活率，差異有統計學意義(F=46.126、222.194、168.406、494.395、989.943，P<0.001)。這表明持續的NIR光照射能夠使治療部位溫度升高并促進DOX的釋放，將光熱療法與化學療法相聯合，顯著地提高體外抗腫瘤效果。

圖7 不同濃度ZnxNi1-xS@DOX納米顆粒與4T1細胞共同培養24 h細胞存活率與ZnxNi1-xS@DOX組比較：***P<0.001

3 討論

由于環境惡化及飲食習慣不健康等因素，惡性腫瘤已成為嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。手術切除、放療等常規的治療方法因其創傷較大、難以徹底清除病變組織、易于復發等局限性，已經不能滿足現實需求[9]。近年來，納米科技的快速發展為腫瘤的治療提供了新的選擇，PTT因其獨特優勢已成為腫瘤治療領域研究的熱點。在NIR光作用下，PTT能夠通過光熱劑在近紅外區的能量轉換作用，使腫瘤區域溫度快速升高，并誘導腫瘤細胞死亡[10-11]。然而，單一的PTT可能存在治療不徹底、用藥劑量大等局限性，為了進一步提高抗腫瘤功效，可將PTT與化學療法聯合，構造能夠進行光熱-化學療法聯合治療的納米體系。

本研究使用溶劑熱法成功合成了ZnxNi1-xS納米結構，該納米顆粒分散性良好且尺寸均一，平均直徑約為300 nm。光熱性能研究實驗表明，ZnxNi1-xS溶液濃度為0、30、60、90、120、150 μg/ml時，NIR光持續照射10 min后，溫度分別升高至32.5、36.0、39.6、42.3、47.1、53.5 ℃，其光熱效果具有明顯的濃度依賴性。此外，其光熱性能還表現出功率依賴性，當激光器功率為1.0、1.5、2.0 W/cm2時，溫度分別為28.98、45.10、53.50 ℃。以上表明所合成的ZnxNi1-xS納米結構是一種良好的光熱納米材料。生物相容性評估表明ZnxNi1-xS納米結構對正常細胞無明顯毒性，具有良好的生物安全性，能夠用于后續研究。基于ZnxNi1-xS納米顆粒中空結構的獨特優勢，可將其作為載體，構建藥物遞送體系，使其負載DOX得到ZnxNi1-xS@DOX納米結構。通過改變溫度模擬光熱升溫，調節介質pH值模擬腫瘤組織微酸性環境，探究DOX的釋放行為，藥物釋放結果表明，溫度升高、pH降低及NIR光照射都能顯著地提高DOX的釋放速率。當介質pH為5.0，溫度升高至45 ℃時，ZnxNi1-xS@DOX納米結構的藥物的釋放率可達到約60%。此外，DOX的釋放行為還表現出NIR光響應性，黑暗條件下釋放率約為13%，在NIR激光器打開狀態下，DOX的釋放速率約為46%，約為黑暗條件下的3.5倍，這可能是因為在808 nm激光器的照射下，ZnxNi1-xS的光熱效應使得溶液溫度升高，促進了DOX的釋放。MTT實驗也證實在NIR光照射下，ZnxNi1-xS@DOX納米結構能夠更加顯著地殺傷腫瘤細胞，當ZnxNi1-xS@DOX濃度為100 μg/ml時，無NIR光照射條件下，4T1的存活率約為70%，而NIR光照射下4T1細胞存活率約為10%，表明該材料具有良好的抗腫瘤功效，對于臨床治療具有重要意義。

綜上所述，ZnxNi1-xS@DOX納米結構能夠有效的聯合光熱療法和化學療法，對腫瘤細胞進行殺傷，作為一種新型的抗腫瘤材料，具有廣闊的應用前景。