急性髓系白血病SIRT3的表達

張 妍，楊明珍

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種以造血干細胞異常生長和分化為特征的惡性疾病，具有增殖、存活和分化異常的特點[1]，據最新統計，其死亡病例數占所有惡性腫瘤死亡病例的3.1%[2]。白血病常見的治療方法主要有化學治療、分子靶向治療及造血干細胞移植等治療手段。其死亡的主要原因仍然是化療耐藥導致的難治性或復發性疾病[3]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是有氧呼吸的代謝副產物，維持細胞內氧化還原動態平衡。增高癌細胞ROS水平，會使其比正常細胞更易受到氧化應激誘導的細胞死亡[4]。去乙酰化酶3(sirtuin 3，Sirt3)是主要位于線粒體中的去乙酰化酶，能夠調節異檸檬酸脫氫酶2(isocitrate dehydrogenase 2，IDH2)、ROS的表達，可作為提高AML標準化療藥物療效的潛在治療靶點[5]。基于此，該研究探討AML患者SIRT3、IDH2與ROS的表達及其在臨床診斷和療效評價中的應用價值，以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2020年10月—2021年12月安徽醫科大學第一附屬醫院收治的新診斷的AML(非APL)患者20例作為新診斷組，其中男9例，女11例；18.00～86.00歲，中位年齡57.00歲。2例未進行融合基因AML1-ETO檢測，16例檢測陰性；2例患者融合基因AML1-ETO陽性。治療后AML(非APL)患者40例作為經治組，其中男22例，女18例；18.00～65.00歲,中位年齡51.50歲。7例未進行融合基因AML1-ETO檢測，25例檢測陰性；8例患者融合基因AML1-ETO陽性。其中完全緩解者20例，部分緩解者20例。完全緩解者20例中，根據不同患者治療療程，以中位數6個療程為界，其中少于等于6個治療療程11例，高于6個治療療程9例。均經骨髓細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學等檢測后確診為急性髓系白血病。20例正常人作為對照組。本研究經安徽醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會審核通過(批號：PJ2021-16-14)，以及取得患者知情同意。

1.1.1對照組納入標準 ① 血常規、肝腎功能無異常，既往無腫瘤史、自身免疫性疾病病史；② 排除合并其他腫瘤性、血液性、傳染性、免疫性疾病。

1.2 主要實驗材料及試劑IDH2 ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；SIRT3 ELISA試劑盒購自武漢基因美公司；酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡購自德國蔡司公司。FBS胎牛血清、RPMI-1640培養基、無水二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、Hank′s平衡鹽溶液(Hank′s balanced salt Solution,HBSS)、杜氏磷酸緩沖液(Dulbecco′s phosphate-buffered saline，D-PBS)、 2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酯(DCFH-DA)、線粒體綠色熒光探針(MITO-Tracker Green)均購自上海碧云天生物技術有限公司；人淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 分離骨髓單個核細胞常規骨髓穿刺，抽取新診斷組、經治組患者及對照組骨髓液3 ml，加等量無菌PBS液用吸管反復吹打、充分混勻。加入等體積的分離液于無菌管中，將稀釋后的骨髓液緩慢平鋪到分離液上方，按照說明離心后小心吸取中間的白膜層，加入PBS液，用吸管反復吹打、混勻、離心，去上清液后將細胞收集。

1.4 測量骨髓單個核細胞內ROS的表達以1 ∶2 000的比例用無血清培養液稀釋DCFH-DA，至終濃度為5 μmol/L。收集細胞，重懸于稀釋的DCFH-DA中，吹打均勻后置入細胞培養箱中避光孵育20 min，用無血清培養基重懸細胞進行洗滌，以去除未進入細胞內的檢測試劑。收集各組細胞于倒置熒光顯微鏡下觀察，實時監測各組平均熒光強度。并用Image J軟件分析。

1.5 測量骨髓單個核細胞線粒體內ROS表達Mito-Tracker Green用無水DMSO配制至終濃度為1 mmol/L，作為儲存液與HBSS按照比例配制成工作液。將各組已提取的骨髓單個核細胞加入適量Mito-Tracker Green工作液，吹打均勻后37 ℃避光孵育30 min，離心取上清液，無血清培養基重懸，全程避光，倒置熒光顯微鏡下觀察，監測各組平均熒光濃度，并用Image J軟件分析。

1.6 ELISA方法檢測外周血血漿標本IDH2、SIRT3的表達抽取新診斷組、經治組患者及對照組外周血3 ml置于含檸檬酸鈉管中，常溫下1 500 r/min離心10 min，收集上清液；按試劑盒說明測定外周血血漿IDH2、SIRT3的表達情況，并在平板閱讀器上于450 nm處立即測量吸光度。用二次多項式擬合曲線計算IDH2、SIRT3濃度。

1.7 觀察指標及評價標準分析比較AML(非APL)各亞組患者實驗室檢查、治療療效及不同治療療程中SIRT3的表達。

2 結果

2.1 ROS在骨髓單個核細胞中的表達相比較對照組，新診斷組中ROS表達明顯上調，差異有統計學意義(P<0.05)。相較于新診斷組，經治組ROS表達明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 三組骨髓單個核細胞ROS表達 ×200A：新診斷組；B：經治組；C：對照組；D:三組骨髓單個核細胞平均熒光強度；與對照組比較：*P<0.05；與新診斷組比較：#P<0.05

2.2 ROS在骨髓單個核細胞線粒體中的表達相比較對照組，新診斷組ROS表達上調差異具有統計學意義(P<0.05)。相較于新診斷組，經治組ROS表達表達明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 骨髓單個核細胞線粒體ROS的表達 ×200A：新診斷組；B：經治組；C：對照組；D:三組骨髓單個核細胞線粒體平均熒光強度；與對照組比較：*P<0.05；與新診斷組比較：#P<0.05

2.3 各組間SIRT3、IDH2水平變化相較于對照組，新診斷組中IDH2的表達上調，差異具有統計學意義(P<0.000 1)；相較于新診斷組，經治組中IDH2的表達下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；組間F=13.048，P<0.05。外周血標本稀釋5倍后，相較于對照組，新診斷組中SIRT3的表達下降，差異具有統計學意義(P<0.000 1)；相較于新診斷組，經治組中SIRT3的表達上調，差異具有統計學意義(P<0.01)；組間F=17.740，P<0.05。見圖3。

圖3 各組間人血漿IDH2、SIRT3表達與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1；與新診斷組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4 SIRT3表達水平與融合基因AML1-ETO的關系

2.4.1新診斷AML患者SIRT3表達水平與融合基因AML1-ETO的關系 20例新診斷AML患者中，2例未進行融合基因檢測，16例檢測陰性；2例患者融合基因陽性。融合基因檢測陽性組SIRT3表達為(626.73±11.89) ng/L，融合基因檢測陰性組SIRT3表達為(591.54±127.29) ng/L，比較融合基因陽性組和陰性組AML患者SIRT3表達水平，結果顯示，兩組間SIRT3表達水平差異無統計學意義(F=3.267，P>0.05)。

2.4.2經治AML患者SIRT3表達水平與融合基因AML1-ETO的關系 40例經治AML患者中，7例未進行融合基因檢測，25例檢測陰性；8例患者融合基因陽性。融合基因檢測陽性組SIRT3表達為(759.96±114.81) ng/L，融合基因檢測陰性組 SIRT3表達為(751.66±241.87) ng/L，比較融合基因陽性組和陰性組AML患者SIRT3表達水平，結果顯示，兩組間SIRT3表達水平差異無統計學意義(F=0.951，P>0.05)。

2.5 經治患者SIRT3表達水平與治療療效之間的關系40例經治AML患者中，其中完全緩解(CR)者20例，部分緩解(PR)者20例。完全緩解者，其SIRT3表達為(722.95±172.33) ng/L；部分緩解者，其SIRT3表達為(794.57±259.61) ng/L，完全緩解者與部分緩解者間SIRT3表達水平差異無統計學意義(F=0.156，P>0.05)。

2.6 經治CR患者SIRT3表達水平與治療療程之間的關系40例經治AML患者中，其中完全緩解者20例，根據不同患者治療療程，以中位數6個療程為界，其中少于等于6個治療療程11例，其SIRT3表達為(712.79±183.43) ng/L；高于6個治療療程9例，其SIRT3表達為(735.36±167.82) ng/L，兩組間SIRT3表達水平差異無統計學意義(F=0.190，P>0.05)。

3 討論

SIRT3主要分布于線粒體，不僅具有去乙酰酶活性，并且能夠靶向多條代謝途徑，調節細胞的正常代謝和功能[6]。文獻報道，SIRT3的丟失，與高氧化應激和ROS的產生以及代謝重編程有關，且后者有助于癌癥的發生[7]。有研究[8]表明，外周血血清與腫瘤細胞中SIRT3的表達有一定的相關性，且其可能成為腫瘤無創性檢測的潛在生物標志物。本研究中，白血病患者外周血SIRT3含量均低于對照組，表明在急性髓系白血病的發生發展中，SIRT3可能參與調節細胞的氧化損傷，調控腫瘤的發生發展。而已確診為AML的患者中，其中新診斷組低于經治組，在經治組中，PR亞組SIRT3水平高于CR亞組，而在經治組中經治療獲得CR的患者中，治療療程較短的亞組，其SIRT3水平低于治療療程長的亞組，與文獻報道一致，提示SIRT3高表達可能參與原發耐藥。在后續實驗中可進一步擴大實驗樣本量以明確。IDH2是三羧酸循環中一種關鍵酶，SIRT3可通過去乙酰化IDH2，以提高細胞抗氧化能力。研究[9]證明，將穩定表達SIRT3的細胞中的IDH2基因敲除，會導致氧化應激保護完全或幾乎完全喪失。本研究結果提示，急性髓系白血病患者IDH2表達均大于對照組，新診斷組表達大于經治組，借此推斷白血病細胞氧化還原的動態平衡被打破，而不排除系SIRT3參與的協調作用。融合基因在疾病的診斷、預后及治療療效評估中起著重要的作用。本研究中，在新診斷及經治患者中，SIRT3的表達與融合基因AML1-ETO陽性與否無明顯關聯。但是本研究中新診斷患者只有2例AML1-ETO基因陽性，病例數較少，無法得出統計學意義，不能明確說明SIRT3的表達并不受其影響，需后期增大樣本量進一步探究。

氧化應激通常被定義為ROS生成和抗氧化防御系統受損之間的失衡。且已有研究[10]證明它與癌癥的病理生理學有關。本研究結果提示，60例已確診為急性髓系白血病患者細胞內及線粒體內ROS水平均明顯高于對照組，與相關文獻[11]報道相似，表明白血病細胞氧化還原平衡被打破，產生大量ROS。有研究顯示，血紅素加氧酶-1(haem oxygenase-1，HO-1)可以調節細胞血紅素水平，增加抗氧化劑的生成。相較于健康對照組，AML患者的HO-1的表達下調，但針對AML的兩種常用化療藥物阿糖胞苷和柔紅霉素在誘導細胞凋亡過程中，可以增加HO-1的表達，與治療前對比有所恢復[12-13]。上述研究說明，化療后的白血病細胞抗氧化能力較前提高。本研究中，經治組患者白血病細胞ROS表達低于新診斷組，表明治療后患者細胞具有較前增高的抗氧化能力。低表達ROS的腫瘤細胞通常會表現出更高的耐藥性，在本研究中，新診斷組ROS表達高于經治組，表明在經多次化學治療后，治療療效較前欠佳。骨髓單個核細胞中線粒體ROS表達也出現同骨髓單個核細胞一樣的表現，表明結果穩定可靠。ROS既能誘導腫瘤的發生，又具有抗腫瘤性及參與細胞耐藥，ROS在細胞內的水平可以通過SIRT3靶向多種底物以調節線粒體的代謝而調節，那么可以通過調節SIRT3的水平而降低腫瘤細胞的耐藥性，使之可能成為潛在的治療靶點，改善疾病的預后及治療療效。

復發、耐藥是AML患者治療效果差的主要原因[14]。本研究顯示在不同疾病狀態的AML患者中，SIRT3、IDH2及ROS表達水平相應改變，解釋了AML患者耐藥的可能機制，但尚未明確SIRT3、IDH2及ROS之間的因果關系，后續可通過建立模型及進一步擴大樣本量驗證探明。

綜上所述，SIRT3在成人急性髓系白血病患者中表達下降，可通過調節氧化應激以增加細胞ROS的產生。SIRT3的異常表達可參與白血病細胞耐藥機制。研究SIRT3在急性髓系白血病細胞生長發育中的功能，可作為評估患者誘導治療及治療療效評估的指標。有助于研究出更多具有針對性、特異性的治療藥物，改善預后，降低復發率。