lbp基因敲除改善膿毒癥大鼠肝臟炎癥性損傷及其作用機制

馬文瀟，陳姝文，劉海峰，易昕睿，王 永，賀智翔，何茂章，薛 敏，唐云書，閆 妍，程文慧，朱亞玲

膿毒癥是由炎癥反應引起宿主器官功能障礙的疾病，具有發病率高、病死率高等特點，是急危重癥醫學面臨的重要臨床問題[1]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)又稱內毒素，是膿毒癥的主要致病因素之一[2]，而LPS結合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein, LBP)是肝臟分泌的急性反應期蛋白，可特異性結合LPS，并促進形成脂多糖/Toll樣受體4/分化群14(lipopolysaccharide/toll-like receptor 4/ cluster of differentiation 14, LPS/TLR4/CD14)復合物，激活Toll樣受體4/髓樣分化蛋白88/核因子κB(toll-like receptor 4/myeloid differentiation-88/nuclear factor kappa-B, LR4/MyD88/NF-κB)信號通路[3]，引起炎癥反應，并誘發肝臟損傷[4]。研究表明lbp基因敲除(lbp-/-)或可減輕LPS誘導的肝臟炎癥損傷[5]，然而其具體的調節機制并未闡明。該研究以lbp-/-大鼠為對象，通過注射LPS刺激誘導肝損傷為模型，基于轉錄組測序揭示lbp基因在膿毒癥相關肝臟炎癥損傷發生中的作用及其機制，為膿毒癥的防治提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 10只體質量(230±20)g SPF級SD雄性大鼠，即野生型(wild type, WT)組，由北京生命河實驗動物技術有限公司提供。委托南京大學-南京生物醫藥研究院構建與WT大鼠具有相同的遺傳背景的lbp基因敲除(lbp-/-)大鼠10只，即lbp-/-組。

1.1.2主要試劑與儀器 亞致死性LPS注射液(大腸埃希菌O55 ∶B5)購自美國圣路易斯西格瑪-奧爾德里奇公司；美洛昔康購自美國TargetMol公司；5%異氟醚購自上海雷門公司；TRIzol?Reagent購自美國Invitrogen公司；IL-6和TNF-α試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；RNA逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。自動化學分析儀(拜耳Advia 1650)購自德國勒沃庫森公司；PCR儀(2506261)購自德國Biometra公司；實時定量PCR儀(CF-X96TM)購自上海伯樂技術有限公司；石蠟切片機(RM2235)購自德國Lecia；電子顯微鏡(JEM1400)購自日本電子株式會社。

1.2 方法

1.2.1急性肝臟炎癥損傷模型構建 動物環境符合標準的動物護理條件，大鼠可以隨意飲水和進食，在實驗前適應7 d。對大鼠實施麻醉(混合有3%異氟醚的氧氣流量0.5 L/min)至大鼠不再有疼痛反射，注射亞致死性LPS注射液(2 mg/kg，靜脈注射)，美洛昔康(0.2 mg/kg，皮下注射)用于術后鎮痛。給予LPS 1 h后，用5%異氟醚處死大鼠，從其下腔靜脈采血并收集肝組織。

1.2.2測定肝酶和促炎因子水平 采用生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)水平以評估肝損傷情況，通過RT-PCR檢測促炎因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)以評估炎癥水平。

1.2.3組織蘇木精-伊紅染色 取大鼠肝臟組織，置于4%多聚甲醛固定24 h后乙醇梯度脫水，后在二甲苯中進行透明化處理，行浸蠟、包埋、切片、脫蠟與蘇木精-伊紅染色、漂洗、復染和封片等一系列常規處理后，制作組織切片。光學顯微鏡下觀察肝臟組織形態特點。

1.2.4組織RNA測序及差異性分析 將凍存的組織經液氮研磨成粉，加入1 ml TRIzol?Reagent室溫裂解細胞5 min，隨后按照TRIzol?試劑說明書，提取細胞的總RNA，并將成功提取的RNA樣本送至諾禾致源測序公司進行建庫測序。測序得到原始測序數據(raw reads)，去除接頭和低質量數據，過濾后得到待分析數據(clean reads)，使用Fastqc軟件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)對clean reads進行質控，檢查測序的整體質量，并采用STAR-2.5.3a(https://github.com/alexdobin/STAR)軟件將clean reads比對到大鼠基因組上，利用DESeq2 R包軟件(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html-/DESeq2.html)進行標準化，轉化為百萬外顯子的堿基片段即基因的表達量值(FPKM)，并進行差異分析，設定篩選差異表達基因(differential expressed genes,DEGs)閾值為P<0.05 & |log2(Fold Change)|≥1.5，其中Fold Change為lbp-/-組與WT組的差異倍數。

1.2.5差異基因注釋、GO和KEGG富集分析 針對WT組和lbp-/-組肝細胞的DEGs，利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp#)和PANTHER(http://www.pantherdb.org/)進行功能富集分析及通路分析，從而揭示差異基因影響的生物學過程。

1.2.6RT-PCR檢測mRNA表達水平 為進一步驗證轉錄組數據結果，選取4個代表性差異基因，利用qPCR技術進行mRNA表達水平的定量分析。同1.2.4方法提取細胞內總mRNA后進行PCR實驗，按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄獲得cDNA。設計引物序列，將含有擴增序列的cDNA為模板進行PCR反應。反應條件為：95 ℃初始變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，擴增40次循環。反應結束后記錄各組結果，采用2-ΔΔCt的計算方式，以GADPH作為內參記錄目的基因的相對表達量。

2 結果

2.1 LPS誘導對lbp-/-大鼠和WT大鼠肝臟損傷的影響使用生化分析儀檢測WT組和lbp-/-組大鼠血清ALT和AST。結果顯示，與WT組相比，lbp-/-大鼠血清中ALT、AST水平降低(P<0.05)，見圖1A。同時，利用RT-PCR檢測LPS注射后WT大鼠和lbp-/-大鼠促炎因子TNF-α、IL-6的表達水平，相比WT組，lbp-/-組大鼠血清IL-6降低(P<0.05)，但TNF-α差異無統計學意義(圖1B)。此外，肝臟組織HE染色結果表明，lbp-/-組炎癥細胞浸潤程度低于WT組(圖1C、D)。綜上，該結果提示敲除lbp基因可減輕LPS引起的肝臟損傷，降低炎癥因子的表達水平。

圖1 LPS誘導對WT組和lbp-/-組肝臟損傷的影響 ×400A：肝酶水平差異；B：促炎因子水平差異；C：WT組HE染色切片；D：lbp-/-組HE染色切片；與WT組比較：*P<0.05

2.2 RNA-Seq測序統計分析LPS誘導后，對WT組與lbp-/-組肝臟RNA-Seq樣本進行檢測(圖2)。通過對原始數據進行質量評估，得到總測序讀數約為65.1(56.2～87.8)M。利用STAR進行比對后，唯一比對讀數約為49.7(43.7～66.2)M，總比對率約為93.0%，唯一比對率約為76.5%，表明測序組裝結果可用于進一步分析,見表1。

表1 RNA-Seq測序樣本的唯一匹配數目[M，n(%)]

圖2 RNA-Seq建庫測序及數據處理流程

2.3 LPS誘導對lbp-/-大鼠和WT大鼠肝臟轉錄組水平的影響利用RNA-seq技術對比lbp-/-大鼠和WT大鼠肝臟轉錄水平，以P<0.05 & |log2(Fold Change)|≥1.5為閾值，共鑒定168個差異表達基因，包括lbp-/-組上調的101個基因和WT組上調的67個基因(圖3A)。為進一步描述lbp-/-組和WT組差異基因表達圖譜，以P<0.01 & |log2(Fold Change)|≥1.5為條件，對所得差異基因進行聚類分析，如圖3B所示，結果表明，Kat14、Gtf2i、Itih4、Rps6ka4、Gorasp2等基因在lbp-/-組顯著上調(P<0.01 & |log2(Fold Change)|≥1.5)，且這些基因參與免疫反應和脂質代謝過程，表明敲除lbp基因可能通過下游免疫反應及脂質代謝相關基因，調節LPS誘導的膿毒癥的炎癥反應；而Vadc2、Pfn1、Ube2c、Tars等基因顯著下調(P<0.01 & |log2(Fold Change)|≥1.5)，這些基因主要作用于細胞凋亡、離子穩態及氧化應激過程，提示敲除lbp基因可能在LPS誘導的膿毒癥的細胞凋亡中起重要作用。見表2。

圖3 WT和lbp-/-大鼠肝臟的轉錄差異表達情況A：WT組和lbp-/-組差異基因的火山圖；藍色：下調；紅色：上調；B：WT組和lbp-/-組顯著差異表達基因的轉錄圖譜

表2 WT組和lbp-/-組標記的顯著差異基因

2.4lbp-/-大鼠和WT大鼠差異基因的功能富集分析為闡明lbp-/-調節的下游DEGs的功能，利用GO富集分析列出富集到的20項生物學條目，WT組和lbp-/-組各10項，根據P值排列，見圖4A。結果表明，WT組高表達的DEGs(如Vadc2、Pfn1、Ube2c、Tars等)主要富集在脂質結合和磷脂酰膽堿生物合成等過程，而lbp-/-組高表達的DEGs(如Kat14、Gtf2i、Itih4、Rps6ka4、Gorasp2等)主要富集到能量代謝和氧化還原等過程。此外，通過KEGG通路富集分析，結果顯示，lbp-/-組上調的DEGs主要富集到過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR)信號通路和類固醇激素生物合成信號通路，見圖4B。

圖4 LPS誘導后WT組與lbp-/-組差異基因的功能富集分析A：WT組與lbp-/-組差異基因富集的生物學過程；B：WT組與lbp-/-組差異基因富集的相關通路

2.5lbp-/-大鼠和WT大鼠差異基因的mRNA相對表達水平RT-PCR驗證部分差異基因的mRNA相對表達水平，結果顯示，lbp-/-組肝臟組織中，與細胞凋亡及氧化應激相關的下調基因Vdac2和Pfn1相對表達量低于WT組(P<0.05)，如圖5A、B所示；而與脂質代謝及免疫反應相關的上調基因Cyp7a1、Cyp4a2相對表達量高于WT組(P<0.05)，如圖5C、D所示。進一步提示lbp-/-可通過調控下游的脂質代謝和免疫反應相關基因的表達，從而減輕肝組織損傷。

圖5 LPS誘導后WT組和lbp-/-組差異基因的mRNA相對表達水平A：Vadc2 mRNA相對表達水平；B：Pfn1 mRNA相對表達水平；C：Cyp7a1 mRNA相對表達水平；D：Cyp4a2 mRNA相對表達水平；與WT組比較：*P<0.05，***P<0.001

3 討論

由創傷膿毒癥或多器官衰竭引起的死亡占創傷后遲發性死亡病例的80%[6]，當高濃度LPS持續刺激時可導致膿毒性休克的發生。LBP可與LPS結合誘發炎癥反應，越來越多研究表明lbp基因在膿毒癥發生發展中起到重要作用，Song et al[5]發現lbp基因能通過PPAR-CYP4A2通路減輕膿毒癥時肝線粒體的損傷；崔峰 等[7]研究表明lbp基因位點的多態性與膿毒癥易感性存在必然關聯，然而關于lbp基因在膿毒癥中的發生機制及其敲除后對機體下游其他基因的影響并未明確。

本研究以lbp-/-大鼠為對象，采用LPS刺激誘導膿毒癥大鼠模型，基于轉錄組測序技術揭示lbp-/-在膿毒癥相關肝臟炎癥損傷發生中的作用及其機制。其中，lbp-/-大鼠的肝酶ALT和AST水平顯著降低，促炎因子TNF-α、IL-6也相對減少，提示lbp-/-降低肝臟炎癥水平，對肝臟損傷起保護作用。轉錄組差異分析結果進一步揭示lbp-/-組上調的DEGs主要富集在與脂質代謝和免疫反應密切相關的PPAR信號通路上，與Boeckmans et al[8-9]研究一致。

研究報道，PPAR通路與中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps,NETs)的形成密切相關，可參與細菌清除等過程[10]。根據上述結果和文獻，本研究構建了lbp-/-改善膿毒癥可能的分子機制模型(圖6)：在WT大鼠中，LPS可結合LBP刺激TLR4，上調氧化應激及細胞凋亡相關基因(如Vdac2、Pfn1、Ube2c、Tars等)，觸發NF-κB信號傳導途徑，調節免疫、急性期炎癥反應和細胞活性[11]，促進促炎因子如IL-6、IL-8和TNF-α等大量分泌，從而誘導肝組織發生炎癥反應及組織損傷；而lbp-/-顯著影響大鼠脂質代謝及免疫反應相關基因的表達水平，其中Cyp7a1、Cyp4a2、Cyp8b1和Acox2等與膽汁酸的合成代謝有關，可通過法尼酯衍生物X受體(FXR)參與機體代謝，降低脂蛋白水平，抑制游離脂肪酸攝取和三酰甘油合成，加快脂質轉運[12-14]，同時，還通過PPAR信號通路加快脂質分解代謝，并形成NETs參與細菌清除，從而減輕機體的炎癥反應及肝組織損傷。其中，PPARs是包含三種同種型(PPAR-α，PPAR-β和PPAR-γ)超家族的核受體，參與代謝調節等過程：①PPAR-γ在激活信號通路過程中抑制TNF-α、IL-6等促炎因子的表達，在LPS誘導的膿毒癥中，與致病性因素抗炎黏附分子協同，使入侵的LPS與LBP不能相互作用，抑制NF-κB信號傳導途徑，從而抑制炎癥反應[15]；②中性粒細胞吞噬細菌可產生活性氧(ROS)，并通過脫顆粒釋放抗菌因子，形成NETs，加快細菌清除速率[16]。

圖6 lbp基因敲除改善膿毒癥可能的分子機制模型

綜上，本研究以lbp-/-大鼠為對象，通過注射LPS刺激誘導膿毒癥為模型，比較WT組與lbp-/-組肝酶含量和促炎因子水平，基于轉錄組測序技術對比組間DEGs表達情況、生物學功能及通路富集分析等，研究表明lbp基因影響脂質代謝過程和免疫相關基因表達，促進細胞色素家族成員Cyp7a1、Cyp4a2等表達水平上調，且DEGs主要富集于PPAR信號通路，形成NETs參與細菌清除和加快脂質代謝分解等生物學過程，從而減輕炎癥反應及肝臟損傷，減緩膿毒癥的發生發展。然而，lbp基因在膿毒癥的具體調節機制及其作用的信號通路仍需進一步實驗驗證。該研究為膿毒癥治療提供了新的思路。