鐵冬青酸對人肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

楊彩梅，束 軍，鄭江霞，沈繼龍

2020年全球癌癥統計顯示，新發的肺癌病例數約220萬，死亡病例數約179萬[1]，較2018年的數據有增無減[2]。鐵冬青酸(Rotundic acid，RA)存在于鐵冬青、毛冬青等植物的種子、樹皮和樹葉中，是一種天然的五環三萜化合物。研究表明，RA具有抗炎[3]、降低低密度脂蛋白和膽固醇[4]、改善腸道菌群[5-6]等作用。Wang et al[7]研究表明RA可以誘導乳腺癌MCF-7細胞的凋亡；Roy et al[8]研究表明RA可以抑制肝癌HepG2細胞的遷移、侵襲并誘導其凋亡；Feng et al[9]研究表明RA可以抑制結直腸癌Caco2細胞的增殖，但是RA對人肺腺癌細胞的作用研究尚罕見報道。該研究主要觀察RA對人肺腺癌A549和PC9細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,初步探討RA作為抗癌新藥的潛能和可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人肺腺癌A549、PC9細胞購于廣州賽業生物科技有限公司；RA (DST201201-037) 購于樂美天醫藥科技有限公司，20 mg/支，純度≥99%；DMEM、RPMI-1640培養基和胎牛血清購于賽默飛生物化學制品有限公司；胰酶細胞消化液購于新賽美生物科技有限公司；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液購于上海碧云天生物技術有限公司；酪氨酸蛋白激酶2 (janus kinase 2，JAK2) 酶聯免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒、轉錄激活蛋白3 (signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)ELISA試劑盒購于上海源桔生物科技中心；Transwell小室購于美國康寧公司；移液器購于北京博儀恒業科技發展有限公司；酶標儀購于瑞士帝肯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 將人肺腺癌A549、PC9細胞分別置于37 ℃、含有5%CO2的細胞培養箱中。用含有10%胎牛血清、1%抗生素的DMEM培養基培養A549細胞；用含有10%胎牛血清、1%抗生素的RPMI-1640培養基培養PC9細胞。肺腺癌細胞呈貼壁方式生長，視細胞生長狀態進行換液、傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2藥物配制及實驗分組 使用DMSO作為溶劑，將RA溶于其中并配制成100 μmol/L的母液，置于-20 ℃冰箱保存備用。實驗分為細胞對照組(無RA、無DMSO)、空白對照組(僅含培養基)和實驗組(分別含20、40、60、80 μmol/L RA)，CCK-8實驗增加溶劑組(含0.1%DMSO)。

1.2.3CCK-8法檢測不同濃度RA對于A549和PC9細胞增殖能力的影響 取對數生長期的人肺腺癌A549和PC9細胞，制備成合適密度的細胞懸液，取細胞懸液進行96孔板鋪板，分為細胞對照組、溶劑對照組和實驗組，每組設置5個復孔。向每組復孔中加入100 μl細胞懸液，待細胞貼壁后，棄去培養基，向細胞對照組中加入100 μl培養基，溶劑組加入含0.1% DMSO的培養基，實驗組每孔各加入100 μl不同濃度(20、40、60、80 μmol/L) 的RA 溶液。培養24 h后向每孔加入10 μl CCK-8試劑，放回細胞培養箱中孵育1～4 h，調節酶標儀波長為450 nm進行吸光度(A)值檢測。根據A值計算各組細胞活力，細胞活力= (實驗組A值-空白對照組A值)/(細胞對照組A值-空白對照組A值)×100%。實驗重復3次。

1.2.4細胞劃痕實驗檢測不同濃度RA對于A549和PC9細胞水平遷移能力的影響 在6孔板背面用馬克筆均勻劃6條互相平行的直線，確保每個孔中有3根直線通過。取對數生長期的人肺腺癌A549和PC9細胞，制備成合適密度的細胞懸液，向每孔中加入2 ml細胞懸液。將6孔板放入培養箱中，在細胞匯合度達到95%時，用200 μl槍頭垂于橫線劃痕，用PBS清洗后在顯微鏡下拍照即為0 h劃痕寬度。實驗組分別加入2 ml不同濃度RA的無血清培養基，對照組加入2 ml無血清培養基。培養24 h后用PBS清洗6孔板并在同一位置拍照，即為24 h劃痕寬度。用ImageJ軟件分析細胞遷移面積，細胞遷移率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/ 0 h劃痕面積×100%。實驗重復3次。

1.2.5Transwell遷移實驗觀察RA對A549和PC9細胞縱向遷移能力的影響 取對數生長期的人肺腺癌A549和PC9細胞，用含不同濃度RA的無血清培養基調整為合適的細胞密度，每個濃度組取200 μl加入到Transwell上室中，下室中加入750 μl血清濃度為20%的培養基。放入培養箱中培養24 h后，用棉簽擦去上室內的細胞及基質膠，下室用甲醛固定30 min，再用結晶紫染色20 min。在200倍顯微鏡下隨機選取5個視野進行計數。實驗重復3次。

1.2.6Transwell侵襲實驗觀察RA對A549和PC9細胞侵襲能力的影響 按1 ∶8的比例稀釋Matrigel基質膠,每個小室用60 μl基質膠包被，放進培養箱過夜。其余步驟同1.2.5項。

1.2.7ELISA實驗觀察RA對A549和PC9細胞上清液中JAK2和STAT3蛋白表達量的影響 用不同濃度RA培養基培養細胞24 h，吸取上清液，根據JAK2和STAT3測定試劑盒說明書進行處理，調節酶標儀波長至450 nm檢測A值，計算JAK2、STAT3蛋白表達量。實驗重復3次。

1.2.8RT-PCR實驗觀察RA對A549和PC9細胞中JAK2和STAT3 mRNA表達水平的影響 取對數生長期的人肺腺癌A549和PC9細胞，調整為合適的細胞密度，進行6孔板鋪板。用含不同濃度RA的培養基培養24 h。用TRIzol提取細胞中的RNA，將其逆轉錄成cDNA。應用逆轉錄定量PCR儀及SYBR Green試劑盒進行PCR擴增。內參GAPDH的上游引物 : 5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′,下游引物 :5′- GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；JAK2的上游引物:5′-GCGTTGAGAAGACGGTGTG-3′,下游引物:5′-CTGTTGCCTGCTTCTGAAACC-3′；STAT3的上游引物5′- 3′:CAGTATAGCCGCTTCCTGCAA,下游引物:5′-CACAATCCGGGCAATCTCC-3′。

1.3 統計學處理拍攝照片后用Image J 1.52軟件對細胞的遷移面積進行計算，對穿過聚碳酸酯膜細胞進行計數；用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析，以判斷各組間的差異是否有統計學意義；用Graph pad Prism 8.0軟件整理實驗數據并作圖。計量資料用表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RA對A549和PC9細胞增殖能力的影響CCK-8法檢測結果顯示，與細胞對照組相比，RA濃度越高，A549細胞和PC9細胞的細胞活力越低；表明RA抑制了各組A549和PC9細胞的增殖，而且RA的濃度越高，抑制作用越強。該實驗結果還顯示，溶劑對照組與細胞對照組之間的細胞活力差異無統計學意義，可以排除溶劑對細胞增殖的抑制作用。細胞對照組與20 μmol/L實驗組之間，20 μmol/L與40 μmol/L實驗組之間細胞活力差異無統計學意義，細胞對照組與其它實驗組之間的細胞活力差異有統計學意義(F=103.1,P<0.05)。在PC9細胞中，溶劑對照組與細胞對照組之間的細胞活力差異無統計學意義，細胞對照組與20、40 μmol/L實驗組之間的細胞活力差異無統計學意義，其它實驗組與細胞對照組之間的細胞活力差異有統計學意義(F=121.8,P<0.05)。見圖1。

圖1 RA對A549和PC9細胞增殖能力的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

2.2 RA對A549和PC9細胞水平遷移能力的影響劃痕實驗結果顯示，隨著RA作用的時間增加，人肺腺癌A549細胞和PC9細胞的遷移面積也隨之增加。其中細胞對照組向劃痕的空白處遷移的面積最大，A549細胞對照組水平遷移率約為60%，PC9細胞對照組水平遷移率約為57%，各組RA作用濃度越高，A549和PC9細胞遷移的面積越小，濃度為80 μmol/L的實驗組細胞基本未發生遷移，A549細胞 80 μmol/L的水平遷移率僅約4%，PC9細胞80 μmol/L的水平遷移率約12%。綜上提示，RA對A549和PC9細胞的水平遷移有一定的抑制作用。經統計學分析顯示，各實驗組與細胞對照組之間的劃痕愈合率差異有統計學意義(A549:F=145.5,P<0.05；PC9:F=157.2,P<0.05) 。見圖2～4。

圖2 不同濃度RA對于A549細胞水平遷移能力的影響 ×200

圖3 不同濃度RA對于PC9細胞水平遷移能力的影響 ×200

圖4 不同濃度RA對于A549和PC9細胞水平遷移率的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

2.3 RA對于A549和PC9細胞縱向遷移能力的影響通過對各組Transwell遷移實驗的結果拍攝照片，并用Image軟件對各組細胞進行計數，結果顯示，細胞對照組視野充滿了細胞，而實驗組RA濃度越高，穿過聚碳酸酯膜的細胞數量越少。經統計學分析，穿過聚碳酸酯膜的細胞數量在實驗組與對照組之間的差異有統計學意義(A549:F=610.9,P<0.05；PC9:F=317.1,P<0.05)，表明RA對A549和PC9細胞的縱向遷移有一定的抑制作用。見圖5、6。

圖5 不同濃度RA對A549和PC9細胞縱向遷移能力的影響 結晶紫染色 ×200

圖6 不同濃度RA對A549和PC9細胞縱向遷移抑制率的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

2.4 RA對于A549和PC9細胞侵襲能力的影響結果顯示，RA濃度越高，穿過基質膠的細胞數量越少，表現為一定的濃度依賴性。通過對穿過基質膠的A549和PC9細胞進行計數與分析表明，經過RA處理之后，上述兩種細胞的侵襲能力均被抑制，RA濃度越高，其對A549和PC9細胞侵襲能力的抑制作用越強。在A549細胞中，細胞對照組與20 μmol/L和40 μmol/L實驗組之間的穿過基質膠的細胞數量差異無統計學意義，細胞對照組與60 μmol/L和80 μmol/L實驗組之間的穿過基質膠的細胞數量差異有統計學意義 (F=320.3，P<0.05)。在PC9細胞中，細胞對照組與20 μmol/L實驗組之間的穿過基質膠的細胞數量差異無統計學意義，細胞對照組與其它實驗組之間的穿過基質膠的細胞數量差異有統計學意義(F= 246.1,P<0.05)。見圖7、8。

圖7 RA對于A549和PC9細胞侵襲能力的影響 結晶紫染色 ×200

圖8 RA對于A549和PC9細胞侵襲能力的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

2.5 RA對A549和PC9細胞中JAK2和STAT3蛋白表達的影響研究結果顯示，RA濃度越高，細胞上清液中JAK2和STAT3蛋白表達量越低，呈現一定的濃度依賴性。在A549細胞的上清液中，細胞對照組與20 μmol/L實驗組之間的JAK2和STAT3蛋白表達量差異無統計學意義，細胞對照組與其它實驗組之間的JAK2、STAT3蛋白表達量有統計學意義 (JAK2：F=21.29，P<0.05；STAT3：F=22.16，P<0.05) ；各RA濃度相鄰的實驗組之間JAK2和STAT3蛋白表達量差異無統計學意義。在PC9細胞的上清液中，細胞對照組與20 μmol/L的實驗組之間JAK2蛋白表達量差異無統計學意義，細胞對照組與其它實驗組之間的JAK2蛋白表達量差異具有統計學意義(JAK2：F=22.73，P<0.05)；細胞對照組上清液中的STAT3蛋白表達量與實驗組的差異具有統計學意義(STAT3：F=21.08，P<0.05)。見表1和圖9、10。

圖9 不同濃度RA對于A549細胞上清液中JAK2和STAT3含量的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05

圖10 不同濃度RA對于PC9細胞上清液中JAK2和STAT3含量的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05

表1 不同濃度RA對人肺腺癌A549和PC9細胞上清液中JAK2和STAT3蛋白表達量的影響

2.6 RA對A549和PC9細胞中JAK2和STAT3 mRNA表達水平的影響RT-PCR實驗結果顯示，作用于A549細胞的RA濃度越高，表達的JAK2和STAT3 mRNA水平越低，細胞對照組與20 μmol/L實驗組、20 μmol/L實驗組與40 μmol/L實驗組之間JAK2的mRNA表達水平差異無統計學意義，細胞對照組與20 μmol/L實驗組、60 μmol/L實驗組與80 μmol/L實驗組之間STAT3 mRNA表達水平差異無統計學意義，其它各組之間JAK2和STAT3 mRNA表達水平差異有統計學意義 (JAK2:F=40.44,P<0.05; STAT3:F=32.04,P<0.05)。在PC9細胞中，細胞對照組與20 μmol/L實驗組之間JAK2 的mRNA表達水平差異無統計學意義，細胞對照組與20 μmol/L實驗組、60 μmol/L實驗組與80 μmol/L實驗組之間STAT3的mRNA表達水平差異無統計學意義，除此之外各組之間的JAK2和STAT3 mRNA表達水平差異有統計學意義 (JAK2:F=117.9,P<0.05; STAT3:F=129.0,P<0.05)。見圖11、12。

圖11 RA對于A549細胞JAK2和STAT3 mRNA表達水平的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

圖12 RA對于PC9細胞JAK2和STAT3 mRNA表達水平的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

3 討論

據文獻[10]報道，RA可通過誘導細胞凋亡、誘導p53過表達、阻滯細胞周期、抑制DNA的合成及干擾相關信號轉導通路等多種機制來抑制腫瘤細胞的生長并促進其凋亡。但是RA對人肺腺癌細胞作用的報道罕見。該研究結果表明RA對人肺腺癌A549細胞和PC9細胞的增殖、水平遷移、縱向遷移和侵襲的能力具有一定的抑制作用，而且隨著RA作用濃度的增加，RA對A549細胞和PC9細胞增殖、遷移、侵襲能力的抑制作用也越強，即具有一定的濃度依賴性。這一特點與RA對結直腸腺癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤細胞的抑制作用相吻合。

免疫治療給患者帶來的生存益處很多，但是對免疫藥物敏感而能夠從中受益的人群有限，且肺癌細胞易對免疫藥物產生耐藥性，開發新的有效的抗腫瘤藥物十分必要，中藥提取物在腫瘤治療方面的研究逐漸增多。研究[11]顯示苦參的活性成分槐果堿，具有抑制腫瘤增殖、遷移和誘導腫瘤細胞凋亡等功能。

生物體內包含了很多從細胞膜到細胞核的有效信號傳導途徑。但是其中的JAK/STAT通路是結構上最簡單的范例之一，通過該通路可以實現跨膜受體到細胞核的直接通信。JAK在上游細胞因子等的作用之下可以激活自身的磷酸化，也可以活化下游的STATs，STATs繼而直接結合細胞內的DNA并參與基因表達的調控。JAK2/STAT3信號通路在各種癌癥發生和發展階段中起著至關重要的作用，并且活性JAK2和STAT3通常與更差的預后相關[12]。本研究中未用Western blot對JAK2和STAT3進行檢測，進一步研究可考慮選用以檢測JAK2和STAT3的磷酸化活性水平。

綜上，RA在體外實驗中對于人肺腺癌A549和PC9細胞的增殖、遷移和侵襲能力均具有抑制作用，且呈一定的濃度依賴性。其作用機制可能與細胞JAK2/STAT3通路的負向調控有關。